[发明专利]一种Fmoc-保护氨基酸纯度及相关物质分析方法

权利要求书

1.一种Fmoc-保护氨基酸纯度及相关物质分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、配制Fmoc-Osu杂质对照溶液，精密称取Fmoc-Osu标准品，用稀释剂配置成杂质溶液，摇匀备用；再精密称取Fmoc-保护氨基酸标准品，用稀释剂溶解，加入配制好的杂质溶液，使Fmoc-Osu与Fmoc-保护氨基酸之比为0.1-1.0：100，得到Fmoc-Osu杂质对照溶液；

S2、配制相关杂质对照溶液，精密称取各类相关杂质标准品，分别置于不同容量瓶中，用稀释剂配置成杂质溶液，摇匀备用；再精密称取Fmoc-保护氨基酸标准品，用稀释剂溶解，然后分别加入单一相关杂质配制成的杂质溶液，使单一相关杂质与Fmoc-保护氨基酸之比为0.1-1.0:100,得到多个对照品溶液；

S3、配制系统适应性溶液，精密称取Fmoc-保护氨基酸标准品，用稀释剂溶解，然后加入Fmoc-Osu杂质溶液和各类相关杂质溶液，比例为：Fmoc-Osu：N1：N2：···Nn：Fmoc-保护氨基酸=（0.1-1.0）：（0.1-1.0）：（0.1-1.0）：···（0.1-1.0）：100，其中，N1，N2····Nn表示杂质种类，得到系统适应性溶液；

S4、配制测试溶液，精密称取供试品，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，配置成0.1-1.0mg/ml的样品溶液，摇匀备用；

S5、利用液相色谱法进行检测，其检测条件是：

色谱柱：C18色谱柱；洗脱条件：采用梯度洗脱；

流动相：流动相A：三氟乙酸：水=0.2-1:1000；流动相B：三氟乙酸：乙腈=0.2-1：1000；

流速：0.5-1.2ml/min；柱温：20-30℃；进样量：5-20ul；

S6、检测实验，采用两针空白溶液、一针系统适应性溶液、一针Fmoc-Osu杂质对照溶液、一针相关杂质N1对照溶液、一针相关杂质N2对照溶液、一针相关杂质Nn对照溶液、三针测试溶液的方式进入色谱系统，然后进行检测实验，再通过面积归一法对主峰纯度和相关物质进行计算，得到各组分的百分含量；

其中，所述Fmoc-保护氨基酸为Fmoc-Gly-OH时，N1，N2····Nn分别为Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-β-Ala-Gly-OH和Fmoc-Gly-Gly-OH，液相色谱检测的梯度洗脱条件为：在前30-40min内，流动相A从占流动相体积分数的70%逐渐减少到10%，流动相B占流动相体积分数的30%逐渐增加到90%；接下来的0-10min内，维持用90%流动相B进行洗脱；随后的0.08-0.2min内，逐渐增加流动相A至其占流动相的体积分数的70%，同时减少流动相B至其占流动相的体积分数的30%，最后，在含70%流动相A和30%流动相B的条件下继续运行5-40min；

所述Fmoc-保护氨基酸为Fmoc-Phe-OH时，N1，N2····Nn分别为Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-β-Ala-Phe-OH和Fmoc-Phe-Phe-OH，液相色谱检测的梯度洗脱条件为：在前30-40min内，流动相A从占流动相体积分数的60%逐渐减少到0，流动相B占流动相体积分数的40%逐渐增加到100%；接下来的0-10min内，维持用占流动相体积分数100%的流动相B进行洗脱；随后的0.08-0.2min内，逐渐增加流动相A至其占流动相的体积分数的60%，同时减少流动相B至其占流动相的体积分数的40%，最后，在含60%流动相A和40%流动相B的条件下继续运行5-40min；

所述Fmoc-保护氨基酸为Fmoc-Lys(Boc)-OH时，N1，N2····Nn分别为Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-β-Ala-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys（Fmoc）-OH、Boc-Lys（Boc）-OH和Boc-Lys（Fmoc）-OH，液相色谱检测的梯度洗脱条件为：在前30-40分钟内，流动相A从占流动相的体积分数60%逐渐减少到0，流动相B占流动相的体积分数40%逐渐增加到100%；接下来的0-10min内，维持用占流动相体积分数100%的流动相B进行洗脱；随后的0.08-0.2min内，逐渐增加流动相A至其占流动相的体积分数60%，同时减少流动相B至其占流动相的体积分数40%，最后，在含55%流动相A和45%流动相B的条件下继续运行5-40min。