[发明专利]一种具有良好可打印性的细胞3D打印生物墨水制备方法

权利要求书

1.一种具有良好可打印性的细胞3D打印生物墨水制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）取刚死亡的猪下肢，在膝关节处取出肌腱组织，放置于4°C条件下的生理盐水中；

2）将步骤1）肌腱组织使用PBS冲洗后浸泡于甲醇和三氯甲烷的混合溶液中3小时，随后使用甲醇溶液浸泡1小时，再使用PBS溶液冲洗3～5遍，以将肌腱组织上的有机溶液洗干净；

3）将步骤2）洗干净的肌腱组织放到0.25%的EDTA胰酶溶液中，4°C下过夜处理12小时后使用PBS溶液冲洗2-3次；

4）将步骤3）经过处理后的肌腱组织置于2%的十二烷基碘酸钠溶液中后在摇床上处理96小时，然后使用PBS溶液冲洗所述肌腱组织直至所述肌腱组织无泡沫被冲洗出来；

5）将步骤4）脱细胞处理后的肌腱组织在-80°C冰箱过夜冷冻，再放入冻干机中冻干48小时；

6）使用球磨仪将步骤5）冻干的肌腱组织研磨成粉末；

7）使用0.1M盐酸溶液溶解步骤6）的粉末，加入胃蛋白酶，在室温条件下磁力搅拌3小时；

8）72小时后使用10M氢氧化钠溶液调pH值为7.4，加入一定量的10×PBS溶液反溶解了肌腱组织的溶液调整为含有0.33×PBS，得到细胞悬液，本步骤的整个操作过程均在冰上进行；

9）将细胞悬液与墨水在冰上进行混合均匀，制得生物墨水，生物墨水中细胞浓度为3×10⁶个/L；

10）将步骤9）制备的生物墨水放置于3D打印针管中进行打印；

步骤2）中肌腱组织为5mm×5mm×1mm大小的组织块；所述甲醇和三氯甲烷的体积比为50：50；

具体的打印条件如下：针管温度：16°C；打印平台温度：37°C；室温：20°C；挤出压力：40kPa；枪头移动速度：15mm/s；打印层间距为160 µm；线条间距为：1.2mm；

所述生物墨水为牙膏状。

2.根据权利要求1所述的具有良好可打印性的细胞3D打印生物墨水制备方法，其特征在于，刚死亡的猪为使用过量麻醉致死的6个月龄雄性小型猪，在取出肌腱组织后，还要分离并去除周围滑膜组织。

3.根据权利要求1所述的具有良好可打印性的细胞3D打印生物墨水制备方法，其特征在于，在步骤6）中，还包括使用100 µm孔径的网筛过滤粉末。

4.根据权利要求1所述的具有良好可打印性的细胞3D打印生物墨水制备方法，其特征在于，在步骤7）中，还包括使用盐酸溶解粉末后的溶液中，粉末的浓度为30mg/ml，加入的胃蛋白酶的浓度为3mg/ml，并在溶液中加入磁子。

5.根据权利要求1所述的具有良好可打印性的细胞3D打印生物墨水制备方法，其特征在于，步骤10)还包括使用直径200 µm的圆锥形针头进行打印，打印区域放置6cm细胞培养皿。