[发明专利]一种基于谱效关系的金银花质量检测方法

权利要求书

1.一种基于谱效关系的金银花质量检测方法，其特征在于：包括有以下步骤：

(1)金银花HPLC指纹图谱的建立；

所述金银花HPLC指纹图谱的建立包括以下步骤：

供试品溶液的制备为：精密称取金银花粗粉1.0g，过四十目筛，置具塞锥形瓶中，精密加入蒸馏水25mL，称重，回流提取2h，放冷，称重，用蒸馏水补足减失的重量，摇匀，取上清液过0.45μm微孔滤膜，即得分析样品溶液，备用；

混合对照品溶液的制备为：分别精密称取马钱苷、新绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、绿原酸、金丝桃苷对照品适量，加甲醇分别制成单一对照品储备液；分别精密吸取各单一对照品储备液1mL，置10mL量瓶，加入甲醇，摇匀，定容后，即为混合对照品溶液；

HPLC色谱条件为：采用Agilent Eclipse Plus C18色谱柱250mm×4.6mm，5μm；流动相为0.1％甲酸水(A)-乙腈(B)；洗脱梯度0～18min，7％～8％B；18～30min，8％～12％B；30～50min，12％～20％B；50～60min，20％B；60～65min，20％～25％B；65～70min，25％～30％B；70～80min，30％～7％B，进样量10μL，体积流量1.0mL/min；柱温30℃；检测波长：238nm；

(2)金银花抗炎作用研究，包括小鼠耳肿胀试验、角叉菜胶足肿胀试验、慢性棉球肉芽肿试验；

(3)金银花指纹图谱与抗炎谱效关系的建立；采用灰色关联分析方法具体包括以下步骤：

确定分析数列：

把金银花各个药效指标作为参考数列，指纹图谱中的特征峰的峰面积作用比较数列，选择药效指标为参考数列，记为Y(k),k＝1,2,3,...,m；选择特征峰的峰面积为比较数列，记为Xi(k)，i＝1,2,3,...,n；

变量的无量纲化：

计算灰色关联系数：

i＝1,2,3,...,n；k＝1,2,3,...,m；ρ为分辨系数，一般取0.5；

△i(k)＝∣y(k)-χi(k)∣，母序列与子序列的绝对差值；

△min＝minmin△i(k)，两极最小差值；

△max＝maxmax△i(k)，两极最大差值；

计算关联度：

采用层次分析法，计算各药效指标的初始权重系数；

PLSR分析金银花抗炎的谱效关系；

以指纹图谱中各共有峰的峰面积为X，以层次分析得到的金银花抗炎的总药效数据为Y，采用软件SIMCA 14.1进行偏最小二乘回归法相关性分析；计算出各X对应Y的回归系数，其中回归系数代表各X对Y的贡献大小，以此回归系数建模，得回归方程：

Y＝19.0325-0.0346X₁+0.0645X₂-0.0726X₃+0.0401X₄+0.1227X₅-0.0108X₆+0.0309X

₇+0.1406X₈-0.0802X₉+0.0903X₁₀-0.0903X₁₁+0.0661X₁₂+0.0488X₁₃+0.0378X₁₄+0.0428X₁₅+0.1264X₁₆+0.0320X₁₇+0.0736X₁₈-0.0631X₁₉+0.0985X₂₀+0.0209X₂₁+0.0240X₂₂-0.0084X₂₃+0.0614X₂₄-0.0082X₂₅；

(4)基于金银花的谱效关系建立质量评价标准检测金银花质量；基于谱效关联的金银花多指标活性成分评价方法的建立，结合灰色关联度分析法及偏最小二乘分析法结果，选择灰色关联度分析中关联度大于0.7且偏最小二乘法分析中对金银花抗炎药效呈正相关的指纹峰为特征峰，通过计算选择特征峰占总峰面积的比例来制定金银花质量评价方法；

所述金银花的质量评价方法为：采用Agilent Eclipse Plus C18色谱柱250mm×4.6mm，5μm；流动相为0.1％甲酸水(A)-乙腈(B)；梯度洗脱0～18min，7％～8％B；18～30min，8％～12％B；30～50min，12％～20％B；50～60min，20％B；60～65min，20％～25％B；65～70min，25％～30％B；70～80min，30％～7％B，进样量10μL，体积流量1.0mL/min，柱温30℃，检测波长为238nm，采用高效液相色谱仪检测金银花水提液，其特征峰占比色谱峰2、4、5、7、8、10、12、13、14、15、16、17、18、20、21、22、24峰面积之和占色谱峰总面积的百分比不得低于73.0％；

所述特征峰是以绿原酸作为参照峰，特征峰与参照峰的保留时间比值为相对保留时间，其中2、4、5、7、8、10、12、13、14、15、16、17、18、20、21、22、24号特征峰的相对保留时间分别为0.285、0.639、0.817、0.917、0.957、1.025、1.171、1.202、1.367、1.418、1.517、1.557、1.665、1.697、1.754、1.949、2.09；

确定金银花HPLC指纹图谱有25个共有峰。