[发明专利]角鲨烯工程菌株、角鲨烯合成质粒、细胞膜空间扩展质粒及制备方法

说明书

本发明涉及一种角鲨烯工程菌株、角鲨烯合成质粒、细胞膜空间扩展质粒及制备方法，通过构建角鲨烯合成途径的工程菌株，开发微生物细胞工厂，构建与膜面积扩展相关基因的角鲨烯合成单元，从而推进角鲨烯的生物合成和工业化生产进程。该角鲨烯工程菌株、角鲨烯合成质粒及其制备方法在大肠杆菌中合成角鲨烯的绿色合成方法，可以减少对自然资源的依赖和过度开发。并且，其成本较低，能实现大规模的角鲨烯生产，具有巨大的经济效益。

技术领域

本发明涉及一种角鲨烯工程菌株、角鲨烯合成质粒、细胞膜空间扩展质粒及制备方法，属于生物基因工程领域。

背景技术

角鲨烯是由6个异戊二烯连接而成的不饱和三萜类化合物，是人体胆固醇代谢途径中一个关键的中间产物。角鲨烯广泛存在于动、植物或微生物体内。在动物体内，尤以深海鲨鱼的肝脏中角鲨烯含量最为丰富，此外，在牦牛肉中角鲨烯的含量也较为丰富。在植物中角鲨烯的分布也很广，如橄榄油、南瓜籽等均含有丰富的角鲨烯。角鲨烯具有强携氧能力、抗氧化、抗辐射、解毒作用、抑制微生物的生长、调控动物体中胆固醇的代谢以及防癌和抗癌作用等重要生理活性，在食品、医药、化妆品等领域具有广泛应用：①角鲨烯抗氧化、抵御紫外线伤害，可用作化妆品；②角鲨烯可作为药物缓释剂，增强药物的治疗效果；③角鲨烯可摄取大量的氧，加强细胞新陈代谢消除疲劳，已成为功能明确的活性成分，在功能性食品中应用广泛；④角鲨烯是一种良好的自由基清除剂，因其具有抗氧化、降血糖、降血脂等生物活性，可用于保健品的生产加工，如角鲨烯软胶囊(角鲨烯含量为100-500mg/粒)等；⑤角鲨烯常被添加于大豆油、花生油等食用植物油中，抑制或延缓油脂的氧化，从而提高食用植物油的稳定性，延长产品的货架期。

由上述可知，角鲨烯具有很高的经济效益。但是角鲨烯在于动物、植物及微生物中的含量不高。深海鲨鱼是迄今为止从自然界发现的角鲨烯含量较高的动物体之一，随着人们对野生动物保护意识的增强，以鲨鱼为原料提取角鲨烯的途径并不可取，目前角鲨烯仍处于供不应求的状态。

然而，现有的角鲨烯的生产方法主要有植物萃取、化学合成以及生物合成等，植物萃取受限于植物周期且产量低；化学合成要求条件苛刻、生产过程安全性低，最主要的问题是工业合成的成本高昂；而生物合成的方法则采用廉价的培养基及易编辑、生长周期短的微生物，相对于化学合成苛刻的反应条件与高昂的成本，更为廉价、高效。

目前国外学者在生物合成角鲨烯方面做了一些开创性的工作，但由于这些方法在菌种和目的物的得率等方面都还不理想，且存在某些局限性，无法进行大规模生产。

生物合成角鲨烯是一种理想的途径，但关键是要找到一种非常合适且具有实用价值的微生物底盘。而大肠杆菌作为常用的模式生物通常具有以下几个优势：①生长速率快，繁殖迅速；②易于培养；③遗传背景简单；④易进行基因操作。因此，本技术通过改造大肠杆菌使其高效地合成角鲨烯是一种可行的“绿色”方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种角鲨烯工程菌株、角鲨烯合成质粒、细胞膜空间扩展质粒及制备方法，通过开发微生物细胞工厂合成角鲨烯，以较低成本来来提高角鲨烯的产量并实现大规模生产，带来了巨大经济效益的同时，还能减轻对自然生态的破坏。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：一种角鲨烯工程菌株的制备方法，包括以下步骤：

S1、提供IPP和DMAPP的pS-MVA质粒，pTrc99A质粒，以及大肠杆菌菌株E.coli DH5α；

S2、以大肠杆菌基因组为模版，扩增大肠杆菌ispA基因，经EcoRI和BamHI消化后插入到所述pTrc99A质粒的EcoRI和BamHI两位点之间，得到pT-ispA质粒；

S3、以酿酒酵母基因组为模板，扩增角鲨烯Erg9TC基因，经BamHI和Sall消化后插入到所述pT-ispA质粒的中，得到pT-IE质粒；