[发明专利]液相原位荧光杂交检测大肠杆菌O157:H7的鉴定方法、试剂盒和探针

权利要求书

1.一种用于大肠杆菌O157:H7肽核酸原位荧光杂交鉴定的PNA探针，其中，该探针具有如下核苷酸序列：5’-GAGCCTCTTTTATGG-3’。

2.如权利要求1所述的探针，其特征在于，所述探针为荧光染料标记的探针，所述荧光染料为Cy3。

3.用于鉴定大肠杆菌O157:H7的试剂盒，其包含权利要求1或2所述的探针。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括杂交液，所述杂交液pH9.0，且其包含如下组份：20mM Tris，100mMNaCl，0.5％SDS，300pmol/ml PNA探针。

5.液相原位荧光杂交检测大肠杆菌O157:H7的鉴定方法，特征在于，该方法包括如下步骤：

步骤1)细菌的培养及固定：离心收集对数生长期的细菌，用PBS洗涤一次，再用PBS调整菌液浓度，细菌离心，弃PBS，用酒精/PBS固定缓冲液重悬，离心去上清；

步骤2)液相杂交及荧光观察：向步骤1)加入包含有权利要求2所述的探针的杂交液，重悬；样品置于PCR管中，水浴，加入洗涤缓冲液振荡孵育，离心弃上清，第二次洗涤后孵育；洗涤缓冲液悬至一定体积，取涂片显微镜观察。

6.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，所述杂交液pH9.0，且其包含如下组份：20mM Tris，100mMNaCl，0.5％SDS，300pmol/ml PNA探针。

7.根据权利要求6所述的鉴定方法，其特征在于，洗涤缓冲液的pH9.0，且其包含如下组份：10mM Tris，1mM EDTA。

8.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，PBS包含如下组份：7mM Na₂HPO₄、7mMNaH₂PO₄、130mM NaCl。

9.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，该方法具体包括如下步骤：

步骤1)细菌的培养及固定：

将大肠杆菌O157:H7于BHI中37℃培养至对数生长期(约9小时)，收集细菌离心8000g×5min，弃培养液，并用PBS洗涤一次。细菌离心8000g/5min，弃PBS，用50％酒精/PBS固定缓冲液重悬，细菌浓度控制在10⁷～10⁸个/ml，室温固定1小时后置于-20℃可保存6个月；

步骤2)液相杂交及荧光观察：

取100μl固定好的菌体8000g离心5min，弃上清；加入50μl含300pmole/mlPNA探针的杂交缓冲液(室温)重悬；样品于薄壁PCR管中，55℃水浴1.5小时；8000g离心5min，弃杂交缓冲液；加入100μl洗涤缓冲液(预热至55℃)，55℃水浴10min；8000g离心5min，弃洗涤缓冲液，重复洗涤一次20min；取25～30μl洗涤缓冲液重悬，取10μl菌液涂片观察荧光。