[发明专利]一种B淋巴细胞体外培养体系及应用

说明书

本发明属于原代细胞培养技术领域，尤其涉及一种B淋巴细胞体外培养体系及应用。该培养体系利用能够分泌IL‑2等白介素分子的T淋巴细胞系为滋养细胞，以提供B淋巴细胞生长发育所需的微量白介素分子；再加入体外重组表达的、具有高生物活性的三聚体CD40L分子为重要分子，来进一步刺激B淋巴细胞的生长繁殖以及发育；本申请中还对滋养层细胞进行伽玛射线照射处理，使经过预处理的滋养层细胞失去细胞繁殖的能力，但在7‑14天内，仍旧具有蛋白质合成和分泌的能力。本发明提供的新型体外培养B淋巴细胞的培养体系，能够在体外有效地培养来源于兔、羊驼的B淋巴细胞，并能够利用这个方法来开发相应的单克隆抗体。

技术领域

本发明属于原代细胞培养技术领域，尤其涉及一种B淋巴细胞体外培养体系及应用。

背景技术

随着现代生物学的发展，科学家们了解到人或动物体内的抗体，是由脾脏或外周血淋巴细胞中的B淋巴细胞及由此发育而成的浆细胞所产生和分泌。因此，如果能获得单一的B淋巴细胞，则可以从中获得对特定抗原物质均一的、特异性的抗体，即单克隆抗体。

由于能产生相应抗体的B淋巴细胞在体外不能够无限繁殖，因此目前对于单克隆抗体的开发主要依赖于分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在1975年创建的杂交瘤技术。该技术的主要原理是，针对相应的动物种属开发一种体外无限繁殖但不能合成分泌抗体的骨髓瘤细胞(如鼠骨髓瘤细胞、兔骨髓瘤细胞等)，然后将该骨髓瘤细胞在体外和含有分泌抗体的B淋巴细胞的脾脏细胞进行融合，再利用选择性培养基在体外进行培养和筛选，最终获得一种可以在体外增殖而又能分泌单克隆抗体的杂交瘤方法。虽然目前该方法仍然被广泛应用于科学研究、临床诊断和药物开发等多个领域，但是其局限性是显而易见的，主要表现在：1)开发周期长，一般需要4-6个月；2)所获得杂交瘤细胞中编码抗体的基因不稳定：在长期繁殖后，容易丢失，而失去分泌抗体的功能；3)不具有普适性：骨髓瘤细胞的开发费时费力，目前只有小鼠、大鼠和兔有相应的骨髓瘤细胞，且兔的骨髓瘤细胞还处于专利保护期，除了Abcam公司，其他公司均不可得。

所以，如何能够快速、有效、经济的从任何一种经免疫之后的动物中筛选和制备单克隆抗体，并获得稳定的单克隆抗体来源，仍然是目前单克隆抗体制备领域所亟需解决的问题。

目前，随着现代免疫学、分子生物学和细胞分选技术的发展，从人体或经免疫后的动物体内筛选出单个抗体分泌细胞(B淋巴细胞或浆细胞)；然后将所获得的细胞中编码抗体的基因扩增出来，在体外表达产生单克隆抗体的方法，逐渐被广泛应用。因此，如何在体外有效地培养单个抗体分泌细胞，是这个技术路线的关键步骤。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种B淋巴细胞体外培养体系及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明提供的一种原代分离B淋巴细胞的体外培养体系，该培养体系以能够表达分泌白介素2(IL-2)的HuT78细胞株为滋养层细胞、并辅以具有高度生物活性的CD40L三聚体蛋白，能够在体外高效的培养B淋巴细胞并诱导其分泌高浓度的免疫球蛋白(IgG)分子。

本发明是这样实现的，一种B淋巴细胞体外培养体系，包括：滋养层细胞，CD40L蛋白，白介素21和基础培养基；所述滋养层细胞能够分泌白介素2。

进一步地，所述滋养层细胞需经过4500RAD的伽玛射线预处理。

进一步地，所述滋养层细胞需经过佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯诱导，诱导时间为12-24小时，所述佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯的浓度为5-10ng/ml。

进一步地，所述滋养层细胞经佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯诱导后，再使用4500RAD的伽玛射线处理。