[发明专利]一种研究m6A阅读器YTHDF1在卵巢癌发生中的功能和机制的方法

权利要求书

1.一种研究m6A阅读器YTHDF1在卵巢癌发生中的功能和机制的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

1)YTHDF1在卵巢癌组织及正常组织中的表达情况

研究YTHDF1在卵巢癌组织及正常卵巢组织中mRNA和蛋白水平的表达情况，推测YTHDF1在卵巢癌中的可能作用；

2)YTHDF1在卵巢癌中的功能研究

2.1)在多个卵巢癌细胞系中分别过表达YTHDF1或抑制内源性YTHDF1的表达，研究YTHDF1对于卵巢癌细胞表型的影响，包括：细胞增殖、细胞凋亡、细胞迁移及侵袭，确定YTHDF1在卵巢癌细胞中的功能；

2.2)进行小鼠体内的功能实验，通过裸鼠皮下成瘤以及小鼠肝、肺转移实验研究YTHDF1的体内功能；

3)YTHDF1在卵巢癌中的作用机制研究

3.1)使用MeRIP-seq筛选在卵巢癌细胞中具有m6A修饰的mRNA分子；

3.2)使用RIP-seq筛选在卵巢癌细胞中与YTHDF1结合的mRNA分子；

3.3)使用RNA-seq鉴定其稳定性可能受YTHDF1调控的mRNA分子；

3.4)使用polysome-profiling结合RNA-seq鉴定其翻译水平可能受YTHDF1调控的mRNA分子；

3.5)综合以上结果，初步确定YTHDF1所调控的靶mRNA分子，及其在卵巢癌中的功能；

4)YTHDF1作为预测卵巢癌分子靶标的研究

4.1)在大量卵巢癌患者的肿瘤组织标本中调查YTHDF1的表达情况，分析YTHDF1的表达水平与患者总体生存期以及无病进展生存期之间的相关性；

4.2)检测卵巢癌患者血清或外泌体中YTHDF1 mRNA的表达水平，发展通过检测血清或外泌体中YTHDF1 mRNA表达水平来预测卵巢癌患者的有效方法；

5)YTHDF1用于卵巢癌治疗的探索性研究

5.1)将卵巢癌细胞接种于裸鼠皮下，并将皮下肿瘤组织原位移植于裸鼠卵巢建立卵巢癌动物模型；

5.2)在小鼠模型中注射靶向YTHDF1的siRNA，初步建立一套以YTHDF1为靶点的适用于卵巢癌的运用。

2.如权利要求1所述的一种研究m6A阅读器YTHDF1在卵巢癌发生中的功能和机制的方法，其特征在于，在步骤1)中，在卵巢癌患者的肿瘤组织标本中调查YTHDF1的表达水平；

a)收集卵巢癌患者肿瘤组织标本，实时定量PCR检测其中YTHDF1的表达情况；

b)收集卵巢癌患者肿瘤组织标本，提取组织蛋白，进行Western Blot及免疫组化检测其中YTHDF1的表达情况。

3.如权利要求1所述的一种研究m6A阅读器YTHDF1在卵巢癌发生中的功能和机制的方法，其特征在于，步骤2.1)中，分别过表达YTHDF1或抑制内源性YTHDF1的表达，研究YTHDF1对于卵巢癌细胞表型的影响，包括：细胞增殖、细胞凋亡、细胞迁移及侵袭；

a)构建YTHDF1过表达载体与shRNA的重组慢病毒表达载体，与穿梭载体及病毒包装载体共转染293TN细胞，转染48h后离心收集病毒，并用PEG-it浓缩病毒颗粒；使用收获的重组病毒颗粒感染卵巢癌细胞，经流式分选获得稳定过表达和敲低YTHDF1的细胞株，用于后续功能检测；

b)检测YTHDF1过表达及敲低的情况下，对细胞增殖的影响；使用细胞计数和CCK8法检测细胞增殖活性，绘制细胞生长曲线；

c)检测YTHDF1过表达及敲低的情况下，对细胞周期的影响；使用PI染色法检测细胞周期运行情况；

d)检测YTHDF1过表达及敲低的情况下，对细胞凋亡的影响；分别利用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测细胞早期凋亡情况，及TUNEL细胞凋亡检测试剂盒检测细胞中晚期凋亡情况；

e)检测YTHDF1过表达及敲低的情况下，对细胞运动及侵袭的影响；划痕法检测细胞迁移能力和Transwell法检测细胞侵袭能力。