[发明专利]一种高通量测序调取未知RNA全长序列的方法

说明书

本发明公开了一种高通量测序调取未知RNA全长序列的方法，该方法为：根据RNA‑seq获取的全新短片段的序列设计该未知RNA的5’末端和3’末端基因特异性反转录引物，利用反转录酶和基因特异性反转录引物分别合成5’末端和3’末端一链cDNA，之后利用DNA聚合酶I分别合成5’末端和3’末端二链cDNA，将所合成的两个末端二链cDNA合并，超声打断后构建文库并测序，通过生物信息学分析，最终调取未知RNA全长序列。本发明可在一个实验中同时调取未知RNA的5’末端和3’末端序列，具有快速，灵活，灵敏度高和实验成本低等特点。

技术领域

本发明涉及基因检测领域，尤其涉及一种高通量测序调取未知RNA全长序列的方法。

背景技术

调取RNA全长序列对于未知RNA研究是非常必要的。目前有很多调取未知RNA全长序列的方法，最代表性的就是MICHAEL A.FROHMAN等开发的快速扩增cDNA末端(Rapidamplification cDNA ends，RACE)方法，该方法利用末端脱氧核苷酸转移酶(Terminaldeoxynucleotidyl-transferase，TdT)将与oligo(dT)相连的Adaptor引入mRNA的3’末端(3’RACE)或cDNA的3’末端(5’RACE)的多聚腺苷酸(polyA)尾,通过基因特异性引物及Adaptor引物对cDNA末端进行PCR扩增后进行克隆测序。在RACE基础上衍生出几种扩增cDNA末端的方法，例如为了增加锚定引物与cDNA模板结合的稳定性及引物的特异性，在cDNA的3’末端加入poly(dC)尾并在与锚定引物相连的poly(dG)中加入脱氧肌苷的5’RACE方法；将Adaptor在反转录前连接到RNA的5’末端，通过Adaptor引物与基因特异性引物对cDNA的5’末端进行扩增等方法。

对于获取的全新片段较短或同源性较高的未知RNA，因为难于设计合适的基因特异性反转录引物，不适合使用RACE及其衍生方法调取全长。RACE及其衍生方法对引物要求非常严格，不合适的引物可能导致实验失败。5’RACE及其衍生方法首先需要设计基因特异性反转录引物，反转录后在cDNA尾部引入含锚定引物的Adaptor，再使用基因特异性扩增引物与锚定引物进行PCR，产生具有限制性酶切位点靶序列，再进行克隆测序。现常用的RACE方法还需在基因特异性扩增引物和锚定引物之间设计巢式PCR引物进行巢式PCR。总之，RACE及其衍生方法需要设计多对引物，并且随着引物数量的增加，对实验结果的影响也越大。

RACE及其衍生方法都是分别调取RNA的5’末端序列和3’末端序列，实验周期长，操作繁琐，实验成本高。

因此，现有技术有待于进一步发展和进步。

发明内容

针对上述技术问题，本发明实施例提供了一种高通量测序调取未知RNA全长序列的方法。

本发明技术方案如下：

一种高通量测序调取未知RNA全长序列的方法，其中，根据RNA-seq获取的全新短片段序列设计该未知RNA的5’末端和3’末端基因特异性反转录引物，利用反转录酶和基因特异性反转录引物分别合成5’末端和3’末端一链cDNA，之后利用DNA聚合酶I分别合成5’末端和3’末端二链cDNA，将所合成的两个末端二链cDNA合并，超声打断后构建文库并测序，通过生物信息学分析，最终调取未知RNA全长序列。

所述的一种高通量测序调取未知RNA全长序列的方法，其中，该未知RNA的5’末端和3’末端的基因特异性反转录引物设计具体为：5’末端基因特异性反转录引物(GSP1)与RNA-seq获取的全新短片段的RNA序列反向互补，3’末端基因特异性反转录引物(GSP2)与RNA-seq获取的全新短片段的RNA序列同向互补，两个末端基因特异性反转录引物所扩增的片段具有重叠区域。

所述的一种高通量测序调取未知RNA全长序列的方法，其中，还包括：还包括：总RNA提取并去除核糖体RNA。