[发明专利]一种蛋白质标记方法

权利要求书

1.一种蛋白质标记方法，其特征在于：其标记方法包括如下步骤：

细胞的培养：首先从淋巴因子或生长因子中提取细胞因子，再选取培养基将细胞置于其中进行培养；

培养基的制备：向缺乏氨基酸的细胞培养基中加入精氨酸、赖氨酸和脯氨酸，将它们均匀混合并静置一段时间；

蛋白质的提取：通过将上述细胞添加至上述培养基中，使它们进行分裂增殖，再对部分细胞进行收集，之后从其中提取蛋白质；

蛋白质的处理：将蛋白质提取物分别经过蛋白质变性，蛋白质还原和烷基化过程处理，之后再对蛋白质进行酶解处理；

产物的标记：对酶解处理后的产物进行同位素标记，且分别采用轻标记试剂和重标记试剂进行同位素标记；

产物的处理：将两种不同试剂标记的产物在反应后进行冻干，再经液质联用分析后，即可进行蛋白质的定量研究。

2.根据权利要求1所述的一种蛋白质标记方法，其特征在于：所述步骤（3）中，所收集的细胞是经过分裂增殖6次以上的细胞，且在培养时将培养基等量分为三份，以提高试验数据的精确性。

3.根据权利要求1所述的一种蛋白质标记方法，其特征在于：所述步骤（3）中，提取的蛋白质是源自单克隆抗体、双特异性抗体、鼠抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体中的任意一种。

4.根据权利要求1所述的一种蛋白质标记方法，其特征在于：所述步骤（4）中，整个过程在碳酸氢铵水溶液中进行，且溶解的蛋白混合物它们的质量比不同，烷基化过程加入的试剂为二硫苏糖醇或碘乙酰胺中的任意一种。

5.根据权利要求1所述的一种蛋白质标记方法，其特征在于：所述步骤（4）中，蛋白酶为胰蛋白酶、特异性内肽酶 Arg-C、 Lys-C、胰凝乳蛋白酶或弹性蛋白酶中的任意一种或二种以上蛋白酶的组合。

6.根据权利要求4所述的一种蛋白质标记方法，其特征在于：所述步骤（4）中，酶解所用的碳酸氢铵溶液的PH值为8-9，蛋白质和酶的质量比为125:1，所反应的时间为14-17h，且反应的温度为37℃。

7.根据权利要求1所述的一种蛋白质标记方法，其特征在于：所述步骤（5）中，轻标记试剂可以为CH₂O、NaCNBH₃和CH₂O、NaCNBD₃组合中的任意一种，相对应的重标记试剂可以为CD₂O、NaCNBD₃和CD₂O、NaCNBH₃组合中的任意一种。

8.根据权利要求1所述的一种蛋白质标记方法，其特征在于：所述步骤（5）中，轻标记试剂的添加量为0.005-1mol，重标记试剂的添加量为0.005-1mol，且两种添加后的溶液均在相同试剂浓度下进行反应，反应的时间为50-70min。

9.根据权利要求1所述的一种蛋白质标记方法，其特征在于：所述步骤（6）中，产物冻干操作采用的仪器为冷冻干燥仪，且该仪器的型号为Heto lyolab 3000，冷冻的温度为-58℃。

10.根据权利要求1所述的一种蛋白质标记方法，其特征在于：所述步骤（6）中，液质联用分析所使用的缓冲液为丙酮、多聚甲醛、PBS缓冲液中的任意一种或两种以上的组合。