[发明专利]一种磺胺二甲嘧啶核酸适配体筛选方法、试剂盒及应用

说明书

发明提供了一种磺胺二甲嘧啶核酸适配体的筛选方法及其检测试剂盒，其中，试剂盒包括基于氧化石墨烯的荧光适配体传感器；其中，基于氧化石墨烯的荧光适配体传感器包括FAM荧光基团标记的适配体和氧化石墨烯；所述FAM荧光基团标记的磺胺二甲嘧啶核酸适配体序列为核苷酸序列表记载的No 1s。磺胺二甲嘧啶荧光检测试剂盒在检测牛奶或鸡蛋的测试样品中磺胺二甲嘧啶的定量检测的应用。

技术领域

本发明涉及生物技术和食品抗生素残留检测领域。更具体的说涉及磺胺二甲嘧啶核酸适配体筛选方法、试剂盒及应用。

背景技术

磺胺二甲嘧啶，化学名为2-(对氨基苯磺酰胺基)-4,6-二甲基嘧啶，是常见的磺胺类药物，是一种广谱抗菌剂，除用于临床治疗外，还能作为兽药和饲料添加剂，广泛应用于食源性动物的饲养中，通过各种给药途径进入动物体内后，可转移到肉、蛋、奶等动物源性食品中。如果使用不当很容易在动物组织和动物源性食品中产生残留，通过食物链进入人体，对人类健康造成危害。并通过动物粪尿等途径排入外部环境，造成生态毒理污染。为了保障动物源性食品的安全性，各国政府规定了磺胺二甲嘧啶等磺胺类药物在动物源性食品中的最高残留限量(maximum residue limit，MRL)。国际食品法典委员会(CAC)、世界卫生组织(WHO)和美国FDA(食品及药物管理局)规定食品和饲料中磺胺类药物总量不得超过0.1mg/kg，我国规定磺胺类药物在动物源性食品中的最高残留限量为100ng/mL，各种磺胺类药物总量不得超过100ng/mL。因此，建立一种快捷、高效、精确的磺胺二甲嘧啶检测方法，对保证人类饮食健康，减少生态污染具有十分重要的意义。目前，磺胺二甲嘧啶药物的检测大多采用高效液相色谱法、色谱-质谱联用技术和酶联免疫吸附法等方法，这几种方法虽然具有很高的选择性和灵敏度，但是，色谱法的使用需要相对昂贵的分析仪器和专业的技术人员，尤其存在样品前处理过程烦琐，对低含量的目标物提取效率低，样品检测成本高，存在基质干扰，难以实现快速检测等缺点。而酶联免疫吸附法需要制备抗体，而制备药物抗体则需要合成完全抗原并免疫动物，实验周期长，且生物活性受多种因素影响而易于失活。近年来，生物传感器法用于检测药物因其操作简单、检测速度快、价格低廉等优点越来越受到广大科研工作者的关注。基于核酸适配体构建的生物传感器，检测灵敏度高、操作简单、选择性强，在抗生素药物检测中具有良好的应用前景。本发明基于氧化石墨烯对磺胺二甲嘧啶核酸适配体进行了筛选及序列优化，构建了基于氧化石墨烯的荧光适配体传感器，在实际样本牛奶和鸡蛋中成功检出，线性关系好，对磺胺二甲嘧啶的检测开发产品方面奠定了基础。

核酸适配体是一类在体外通过指数富集的配体系统进化技术(SystematicEvolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)筛选出的能与各种目标分子高亲和力、高特异结合的单链DNA或RNA片段，可以通过自身折叠形成二级或三级结构使其对特定靶标(如金属离子、小分子、蛋白、病毒、细胞等)有很强的亲和力，作为分子识别的元件，而广泛应用于医学临床诊断和治疗。

目前已有利用核酸适配体作为探针应用于食品中抗生素检测残留检测的报道，检测方法多以免疫分析法和电化学生物传感器为主，为了确保动物源性食品的质量，保障人类的饮食安全，必须加强食品和环境中磺胺二甲嘧啶残留的检测。

发明内容：

本发明通过非固定GO-SELEX技术的筛选过程，获得了磺胺二甲嘧啶的核酸适配体，通过序列的优化，得到适配体核心识别区域，并克隆体外合成，制得的核酸适配体对磺胺二甲嘧啶具有高亲和力和特异性，构建了基于氧化石墨烯的荧光适配体传感器，当体系中出现磺胺二甲嘧啶时，核酸适配体通过较强的亲和力结合到磺胺二甲嘧啶上，不通过π-π堆积作用吸附在氧化石墨烯表面。由于磺胺二甲嘧啶浓度的不同，结合的荧光基团标记适体产生不同的荧光信号。相反，在没有磺胺二甲嘧啶的情况下，氧化石墨烯可以通过π-π堆积相互作用吸附荧光团标记的适配体，猝灭荧光信号。利用这一原理，实现磺胺二甲嘧啶的定量检测。具体的发明内容为：