[发明专利]生产L-缬氨酸的重组微生物及构建方法、应用

说明书

本发明涉及生产L‑缬氨酸的重组微生物的构建方法，通过向微生物中导入乙酰羟酸异构还原酶基因和/或氨基酸脱氢酶基因，同时增强乙酰羟基还原异构酶和氨基酸脱氢酶的活性，能够提高大肠杆菌生产L‑缬氨酸的产量和转化率，且可实现一步法厌氧发酵L‑缬氨酸。

技术领域

本发明涉及生产L-缬氨酸的重组微生物的构建方法，所述构建方法 获得的重组微生物，具体是重组大肠杆菌，以及通过发酵法生产L-缬氨 酸的方法。

背景技术

L-缬氨酸作为三大支链氨基酸(Branched-chain amino acid，BCAA) 的一种，属于必需氨基酸，在人和动物中不能合成，只能通过从外界补 充获得。目前，L-缬氨酸被广泛用于食品和医药领域，主要包括食品添 加剂、营养增补液及风味剂等；广泛用于化妆品制备、以及用作抗生素 或者除草剂前体等；另外，随着对饲料质量和配比需求的提高，在未来L-缬氨酸在饲料添加剂行业中的作用将越来越重要，需求量会越来越大， 未来市场具有极大的潜力。微生物细胞可以直接合成L-缬氨酸，但胞内 大量反馈抑制等调控网络极大地限制了野生细胞的生产能力。要想获得 能够高效生产L-缬氨酸的发酵菌株，必须有效解除微生物细胞这些自我 调节机制。目前，世界范围内L-缬氨酸主要通过发酵法生产获得。用于发酵的生产菌株多通过诱变而来，出发菌株主要包括谷氨酸棒杆菌、黄 色短杆菌、黄色短杆菌等。陈宁等以黄色短杆菌为出发菌株，使用原生 质体紫外诱变并结合DES化学诱变的策略，筛选获得了一株L-缬氨酸 高产菌TV2564。但是，传统诱变获得的菌株具有很强的随机性，并且 遗传背景不清晰，副产物多，并且不容易进一步通过改造获得更加高产 的菌株。

近年来，随着合成生物学和代谢工程的迅速发展，通过遗传改造获 得能够高效生产L-缬氨酸、遗传背景清晰、且易于培养的重组工程菌株 应运而生并取得了很好的效果。SangYup Lee课题组2007年从大肠杆菌 W3110出发，结合理性代谢工程、转录组分析和遗传改造、以及基因敲 除等手段获得了一株能够生产L-缬氨酸的工程菌。该菌株在好氧条件下批式培养(batch culture)可以生产缬氨酸但其培养过程中需要持续通氧， 且需添加L-异亮氨酸方能保证细胞正常生长。

谢希贤等整合枯草芽孢杆菌乙酰乳酸合酶的编码基因alsS，解除了 L-缬氨酸对合成通路的反馈抑制，同时整合大肠杆菌ppGpp3’-焦磷酸水 解酶的突变基因spo TM，增强了丙酮酸供应，增强了出发菌株VHY03 的摇瓶发酵生产L-缬氨酸的水平。

目前公开报道的L-缬氨酸发酵生产多是通过好氧或者两步法发酵 实现的。但是好氧工艺在生产过程中需要用空气，能耗很大；更关键的 是，有相当一部分碳源进入三羧酸循环(TCA)从而被用于细胞生长， 导致转化率比理论最大值要低很多。厌氧工艺和好氧相比，具有低能耗、 高转化率的优点，生产过程中不需要通空气，大大节约能耗；产品的转化率通常接近理论最大值。氨基酸生产的厌氧发酵最早是在丙氨酸生产 过程中实现的，目前其他氨基酸的生产暂未有纯厌氧发酵工艺的报道。 此外，目前工程菌改造过程中关键基因的过表达都是通过在质粒上实现 的，这就导致发酵过程中需要添加抗生素维持质粒存在，增加了生产成 本并存在在产业化生产中质粒丢失的风险。

因此，本领域仍需要提供稳定、高产、节能、简便的生产L-缬氨酸 的重组微生物以及相应的L-缬氨酸的生产制备方法。

发明内容

本发明发现，原增强乙酰羟基还异构酶和/或氨基酸脱氢酶的活性， 能够提高大肠杆菌生产L-缬氨酸的产量和转化率，且可实现一步法厌氧 发酵L-缬氨酸。

本发明的第一个方面，是提供一种L-缬氨酸的重组微生物的构建方 法，经该方法获得的重组微生物具有稳定遗传背景、且具备平衡的L- 缬氨酸还原力，适宜一步法厌氧发酵。