[发明专利]检测猪瘟病毒的RT-RAA引物、探针和试剂盒及应用

说明书

本发明公开了一种检测猪瘟病毒的RT‑RAA引物、探针和试剂盒及应用，所述检测猪瘟病毒的RT‑RAA引物和探针包括用于鉴定猪瘟病毒5’NTR基因的正向引物CSFV‑5’NTR‑F(SEQ ID NO.1)、反向引物CSFV‑5’NTR‑R(SEQ ID NO.2)和探针CSFV‑5’NTR‑Probe(SEQ ID NO.3)。通过上述引物和探针进行RT‑RAA核酸扩增所得到的扩增结果可以通过便携式蓝光仪进行肉眼可视化判断，可实现对CSFV进行快速、特异、灵敏、简便的检测，从而弥补现有检测技术的不足。

技术领域

本发明是关于动物疫病检测技术领域，特别是关于一种检测猪瘟病毒的RT-RAA引物、探针和试剂盒及应用。

背景技术

猪瘟(classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fevervirus,CSFV)引起猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，特征为高热稽留和小血管壁变性引起广泛出血、梗塞和坏死，具有很高的发病率和死亡率，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类法定传染病之一。猪是本病原唯一的自然宿主，病猪和带毒猪是最主要的传染源。猪瘟对猪危害极为严重，会造成养猪业巨大的经济损失。近年来猪瘟流行和发病特点发生了许多新变化，出现非典型猪瘟、温和型猪瘟，散发性流行，发病特点及临床症状轻或不明显，死亡率低，病理变化不特征，而且常呈隐性感染，给临床确诊带来了很大的困难，须依赖实验室诊断才能确诊。

为了降低猪瘟给养猪业带来的巨大经济损失，需要快速、准确的诊断技术。目前，冰冻切片直接荧光抗体(FA)试验是检查CSFV抗原的方法之一，扁桃体是首选病料，此外血清中和试验、ELISA、PCR、动物接种试验如兔体交互免疫试验等方法，也是目前实验室较常用的检测方法，都可对猪瘟进行确诊，且对该病的诊断和防控发挥了重要作用。常规诊断方法存在操作复杂，需要复杂的仪器设备，所需时间长的缺点，不利于猪瘟的快速诊断，也不适合基层和现场即时检测(point of care testing，POCT)。因此，建立一种快速简便、特异性强、敏感性高的猪瘟病毒检测方法，对该病的诊断和防控具有重要意义。

重组酶介导的等温扩增反应(Recombinase Aided Amplification,RAA)是一种新型的等温体外核酸扩增技术，反应在37-42℃条件下30min内即可得到与传统PCR反应相当的扩增产物。RAA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性。重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，在单链DNA结合蛋白的帮助下，打开模板DNA的双链结构，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，从而对模板上的目标区域进行指数式扩增。

RAA反应简单快速，对仪器要求简单，不需要热循环反应的温度控制仪器。在基础体系中添加逆转录酶，省去了额外的cDNA合成步骤，可以对RNA模板进行一步法扩增。利用exo探针技术和核酸外切酶III，能实现数据的实时读取，就像荧光定量PCR一样。将exo探针技术、核酸外切酶III和逆转录酶结合起来的exo RT-RAA，可以一步实现对RNA模板的实时扩增。该技术具有灵敏度高、特异性和可靠性更好、能实现现场快速检测等特点。再根据探针中的FAM是一种绿色荧光基团，其在蓝光下可以被激发出绿色荧光，因此可以结合便携式蓝光仪器对RAA扩增产物进行可视化的判断，适用于即时检测，是未来核酸检测方面具有推广应用前景的等温扩增技术。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测猪瘟病毒的RT-RAA引物和探针，通过所述引物和探针对猪瘟病毒实施逆转录重组酶介导等温扩增(Reverse transcription recombinase-aided amplification，RT-RAA)，以实现对猪瘟病毒进行快速、特异、灵敏、可视化、简便的检测。