[发明专利]一种11α-羟化酶突变体及其应用

说明书

本发明专利提供了赭曲霉甾体C11α‑羟化酶突变体I303L，DNA序列如SEQ ID NO：2所示。同C11α‑羟化酶CYP68J5相比，突变体I303L转化甾体底物孕酮显示更高的特异性，无明显副产物生成。本发明专利还提供了基于突变体I303L异源过表达的表达载体、毕赤酵母重组菌及其甾体转化工艺，为研究开发高效黄体酮C11α‑羟化生产工艺提供了宝贵材料(基因和菌种)和基础数据支撑。

技术领域：

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种C11α-羟化酶突变体及其应用。

背景技术：

甾体激素类药物在临床上具有广泛的应用。该类药物主要用于治疗炎症和过敏等症状，同时也用于治疗癌症，人体激素分泌障碍以及生育控制。甾体药物的生理和药理活性取决于甾体骨架特定位点引入官能基团。对甾体结构的改造通过化学合成法或微生物转化法，或结合两种方法。全化学合成法存在着合成过程复杂、副产物不容易分离等缺点，故化学合成法难以完成的关键合成步骤，工业上利用微生物转化反应在甾体基本骨架上引入各种不同类型的官能团，尤其是羟基。重要的微生物甾体羟化反应包括在甾体骨架的C9-、C11-、C15-位上引入羟基。

11α-羟基黄体酮是合成甾体孕激素和糖皮质激素的重要中间体。由于赭曲霉(Aspergillus ochraceus)具有较强的C11α-羟基化活性和特异性，甾体工业常用于甾体的C11α-羟化，一步在孕酮的C11位引入羟基合成11α-羟基黄体酮。但赭曲霉转化甾体底物黄体酮存在明显副产物，不仅浪费了原料，同时增加了后续的分离纯化的成本。我们克隆鉴定了赭曲霉TCCC41060中的C11α-羟化酶基因 CYP68J5。

为了改善赭曲霉C11α-羟化酶CYP68J5基因对底物黄体酮的羟化特异性，利用定点突变技术对其进行分子水平上的改造，筛选获得了一个对孕酮具有高羟化特异性C11α-羟化酶突变体I303L，并构建相应的异源表达载体以及过表达重组毕赤酵母菌。发酵结果显示过表达突变体I303L的毕赤酵母重组菌对底物孕酮具有高C11α-羟化特异性和较高的羟化活性，为研究开发绿色高效孕酮C11α-羟化工艺奠定了坚实的基础。

发明内容：

针对现有甾体孕酮羟化技术的不足，本发明的第一个目标是利用分子操作技术提供一种C11α-羟化酶CYP68J5的突变体I303L。本发明的第二个目标是利用表达载体pPIC3.5K实现异源高效表达突变体I303L，构建了一个I303L重组表达质粒以及突变体I303L过表达重组毕赤酵母菌，建立了基于重组毕赤酵母菌的无副产物生成的黄体酮高效C11α-羟化反应工艺。

本发明所述的CYP68J5基因来源于赭曲霉。

本发明未定点突变的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明经定点突变的编码基因DNA序列如SEQ ID NO：2所示。

利用本发明所述的基因片段CYP68J5m303所构建的表达载体、重组载体或宿主细胞也属于本发明的保护范围，所使用的扩增引物序列也属于本发明的保护范围。

本发明所述的经定点突变技术获得的突变基因CYP68J5m303编码的甾体化合物羟化酶可用于但不限于毕赤酵母等宿主细胞内表达。

有益效果：

高效C11α-羟化酶突变体I303L的获得以及重组毕赤酵母黄体酮C11α-羟化工程菌的构建为研究开发高效黄体酮C11α-羟化生产工艺提供了宝贵材料(基因和菌种)和基础数据支撑。

说明书附图：

图1黄体酮的C11α-羟基化反应

图2琼脂糖凝胶电泳验证条带

其中：M为DNA Marker，1为基因片段；

图3重组毕赤酵母质粒构建图