[发明专利]一种双膜包覆的仿生纳米诊疗探针的制备方法

权利要求书

1.一种双膜包覆的仿生纳米探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(a)借助溶剂热方法制备长余辉纳米材料PLNPs；

(b)通过正硅酸乙酯水解法在长余辉纳米材料表面修饰介孔二氧化硅得到PLNPs@SiO₂；

(c)通过脂质体挤出法在PLNPs@SiO₂表面包覆双生物杂化膜得到PLNPs@SiO₂@CMM。

2.根据权利要求1所述的一种双膜包覆的仿生纳米探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)借助溶剂热方法制备长余辉纳米材料的过程如下：

(1)长余辉纳米材料的制备：精准称取1.4874g的Zn(NO₃)₂·6H₂O固体放入50mL圆底烧瓶中，加入10mL的0.6M Ga(NO₃)₃溶液，搅拌，待Zn(NO₃)₂充分溶解后，依次加入300μL的0.1MCr(NO₃)₃溶液，1500μL的0.1M Yb(NO₃)₃溶液，150μL的0.1M Er(NO₃)₃溶液和10mL的0.1M锗酸铵溶液混合搅拌，并调节pH，发生共沉淀反应得到反应液，反应液转移到反应釜中120℃条件下溶剂热反应24小时后，产物离心洗涤并使用玛瑙研钵粗研后于1000℃条件下煅烧反应1小时得到长余辉纳米发光材料PLNPs；

(2)将获得的长余辉纳米粒子粉末置于玛瑙研钵中分别用无水乙醇和5mM的NaOH溶液研磨30min，超声分散到水中，分别经过低速离心和高速离心分离可获得粒径大小较为适中的长余辉纳米粒子PLNPs悬浮液。

3.根据权利要求2所述的一种双膜包覆的仿生纳米探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)溶剂热反应的溶剂为2mL油酸和15mL甲苯，pH调节使用叔丁胺，最终pH为8.0。

4.根据权利要求2所述的一种双膜包覆的仿生纳米诊疗探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中所使用的低速离心方法为3500rpm×7min。

5.根据权利要求2所述的一种双膜包覆的仿生纳米诊疗探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中所使用的高速离心方法为4500rpm×15min。

6.根据权利要求1所述一种双膜包覆的仿生纳米诊疗探针的制备方法，其特征在于，步骤(b)通过正硅酸乙酯水解法在长余辉纳米材料表面修饰介孔二氧化硅的过程如下：

(1)将20.0mg步骤(a)制备出的PLNPs长余辉材料和80.0mg十六烷基三甲基溴化铵进行混合，加入20mL的5mMNaOH溶液超声溶解，在一定温度下剧烈搅拌30min；

(2)向上述溶液中逐滴加入一定体积的5％硅酸四乙酯甲醇溶液v/v)，继续反应90min后，再次滴加一定体积的5％硅酸四乙酯甲醇溶液(v/v)，搅拌反应90min，将反应液转移至50mL聚四氟乙烯高压反应釜于一定温度下反应24h，然后将反应液用乙醇和超纯水各洗涤三次，再用1％氯化钠/甲醇溶液洗涤六次，以去除可能残留的十六烷基三甲基溴化铵，离心收集沉淀，再用超纯水洗涤一次，将所得的固体冷冻干燥24h，即得PLNPs@SiO₂。

7.根据权利要求6所述的一种双膜包覆的仿生纳米诊疗探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中反应温度为25℃。

8.根据权利要求6所述的一种双膜包覆的仿生纳米诊疗探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中两次硅酸四乙酯甲醇溶液的加入量为600μL。

9.根据权利要求6所述的一种双膜包覆的仿生纳米诊疗探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)反应温度为120℃。

10.根据权利要求1所述一种双膜包覆的仿生纳米诊疗探针的制备方法，其特征在于，步骤(c)通过脂质体挤出法在PLNPs@SiO₂表面包覆双生物杂化膜得到PLNPs@SiO₂@CMM的过程如下：

(1)细胞膜的提取过程如下，将处于对数生长期的目标细胞消化离心收集后分散在含0.1％蛋白酶抑制剂的pH 7.4的Tris缓冲液中，使用细胞破碎仪100W将细胞悬液于冰浴下破碎10min，于3200g离心5min，然后取上清经过低速离心和高速离心得到的淡黄色固体即为细胞膜，将细胞膜储存在-20℃冰箱备用；细菌生物膜的提取过程如下，选取目标细菌进行培养，当用酶标仪测得菌体OD600值为0.5后，将10mL含菌培养液在8000rpm4℃条件下离心得到菌体，用适量pH 7.4PBS洗涤后加入100μL溶菌酶，置于37℃摇床破膜20min后于4℃条件下3000rpm离心去除尚未破膜的细菌，取上清用超滤离心管于4℃条件下5000rpm离心10min得到细菌生物膜，将得到的生物膜重悬于10mLpH 7.4的PBS后置于4℃冰箱保存备用；所述低速离心方法为20000rpm×30min；

(2)取适量目标生物膜提前使用细胞破碎仪100W超声10s混合，并用脂质体挤出器挤压混合膜依次通过800nm和400nm聚碳酸酯膜，重复挤出5次；然后将目标生物膜加入步骤(b)制备出的载药PLNPs@SiO₂混合均匀，并用脂质体挤出器依次通过400nm和200nm聚碳酸酯膜，重复挤出5次以将目标生物膜包覆到纳米材料表面，得到载药PLNPs@SiO₂@CMM；所述高速离心方法为80000rpm×90min。