[发明专利]猪卵母细胞体外成熟培养液及其应用

说明书

本发明公开了一种猪卵母细胞体外成熟培养液。该培养液包括胰岛素转铁蛋白硒溶液ITS、成纤维细胞生长因子FGF、白血病抑制因子LIF、肌醇。该培养液应用在卵母细胞体外成熟培养时，无需添加血清及卵泡液，更加安全、稳定、高效。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其应用。

背景技术

随着胚胎移植、冷冻精液技术、克隆转基因技术的发展，卵母细胞需求量越来越大。由于利用猪的超数排卵技术所获得的卵母细胞或者胚胎数量是极其有限的，并不能满足大量优质卵母细胞的需求，而且操作复杂、成本较高，所以体外成熟培养就显得尤为重要。

猪卵母细胞体外成熟是指从屠宰场直接采集废弃卵巢，取出未成熟的卵母细胞后，在体外模拟体内成熟环境来达到成熟的目的。现有的成熟培养体系中，一般是在基础培养液中添加激素类，血清类，生长因子类或者其他小分子物质等达到最佳的体外培养条件。猪卵母细胞常用的基础培养基有NCSU-23和M199,其中M199已有商品化产品，可直接购买。这些化学合成培养基具有适当的渗透压、能源物质、氨基酸、维生素、微量元素及缓冲pH值，以满足卵母细胞体外培养最基本的需要。其他的添加成分需各个实验室根据自身的培养体系来选择性添加。其中，血清含有丰富的营养物质，一般在培养体系中的添加量是10％。但是由于其成份不确定性，想要观察一种生长因子对卵母细胞的作用时，这时很难排除血清中生长因子的干扰作用。已有文章研究出血清的替代产物KSR，可直接购买。另外，猪的卵泡液可以为卵母细胞成熟提供发育的微环境，一般在培养体系中的添加量是10％。能提供卵母细胞生长所需要的激素、维生素、生长因子等营养因素，但是也有不利的方面。首先，因为卵泡液通常是直接抽取从屠宰场采集卵巢的大卵泡所得，每一批次的卵巢质量是不一样的，导致所获得的卵泡液质量也不一样。而且卵泡液中的许多成份随着卵母细胞的生长发育起动态变化，对卵母细胞的成熟起正向或者负向调节作用。其次，猪卵泡液还是潜在的疾病传染源，特别现在非洲猪瘟的常态下，使用屠宰场来源的卵泡液有很大的安全隐患。即使使用前没有检测到非洲猪瘟病毒，可能是由于浓度过低没有检测到。一旦将胚胎移植到受体母猪体内，病毒在体内增值，导致受体猪或周围群猪的感染，损失将是巨大的。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪卵母细胞体外成熟培养液，以解决上述问题。

根据本发明的一个方面，提供了猪卵母细胞体外成熟培养液，其包括胰岛素转铁蛋白硒溶液ITS、成纤维细胞生长因子FGF、白血病抑制因子LIF、肌醇。

在某些实施方式中，培养液中胰岛素转铁蛋白硒溶液ITS的体积分数为0.1-1.5％、成纤维细胞生长因子FGF的质量浓度为10-80ng/mL、白血病抑制因子LIF的质量浓度为10-40ng/mL、培养液中肌醇的质量浓度为1-10μg/ml。

在某些实施方式中，培养液包括：以基础培养液为基准计，碳酸氢钠的浓度为1.99mmol/L、丙酮酸钠的浓度为0.91mmol/L、血清替代物的体积分数为5％、半胱氨酸的浓度为0.57mmol/L、孕马血清促性腺激素PMSG的浓度为10IU/mL、人绒毛膜促性腺激素HCG的浓度为10IU/mL、表皮生长因子EGF的质量浓度为10ng/mL、胰岛素转铁蛋白硒溶液ITS的体积分数为0.1-1.5％、成纤维细胞生长因子FGF的质量浓度为10-80ng/mL、白血病抑制因子LIF的质量浓度为10-40ng/mL、肌醇的质量浓度为1-10μg/ml。

在某些实施方式中，培养液包括：以基础培养液为基准计，碳酸氢钠的浓度为1.99mmol/L、丙酮酸钠的浓度为0.91mmol/L、血清替代物的体积分数为5％、半胱氨酸的浓度为0.57mmol/L、孕马血清促性腺激素PMSG的浓度为10IU/mL、人绒毛膜促性腺激素HCG的浓度为10IU/mL、表皮生长因子EGF的质量浓度为10ng/mL、胰岛素转铁蛋白硒溶液ITS的体积分数为0.5％、成纤维细胞生长因子FGF的质量浓度为40ng/mL、白血病抑制因子LIF的质量浓度为20ng/mL、肌醇的质量浓度为5μg/ml。