[发明专利]一种检测基因编辑靶点切割效率的方法

权利要求书

1.一种检测基因编辑靶点切割效率的方法，其特征在于：检测方法如下：

(1)构建表达移码突变的报告基因的载体，即构件含有基因编辑靶点的移码突变的报告基因；

(2)将步骤(1)构建完成的表达移码突变的报告基因的载体转入细胞；含有基因编辑靶点的移码突变的报告基因克隆到真核表达载体启动子下游，终止子上游；

(3)将内切核酸酶表达原件或者内切核酸酶转入细胞；

(4)检测细胞中报告基因表达量。

2.如权利要求1所述一种检测基因编辑靶点切割效率的方法，其特征在于：所述步骤(1)构建表达移码突变的报告基因的载体方法为：

1)采用DNA突变技术，利用限制性内切酶在报告基因起始密码子ATG下游插入一段DNA序列即基因编辑靶点序列；所述报告基因为荧光蛋白报告基因、催化酶类报告基因中的一种；所述插入的一段DNA序列的碱基数不等于3的倍数；

2)获得含有基因编辑靶点的移码突变的报告基因。

3.如权利要求1所述一种检测基因编辑靶点切割效率的方法，其特征在于：所述荧光蛋白报告基因为EGFP或RFP；所述催化酶类报告基因为萤火虫荧光素酶或海肾荧光素酶；所述内切核酸酶表达原件或者内切核酸酶为荧光蛋白类报告基因和生物酶类报告基因，所述荧光蛋白类报告基因为EGFP报告基因，生物酶类报告基因为萤火虫荧光素酶报告基因。

4.如权利要求2所述一种检测基因编辑靶点切割效率的方法，其特征在于：所述步骤1)中插入的基因编辑靶点序列具有：

1)包含完整的一个或者多个基因编辑靶点序列；

2)插入的包含基因编辑靶点的DNA序列的碱基数为3的倍数。

5.如权利要求1所述一种检测基因编辑靶点切割效率的方法，其特征在于：所述细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞。

6.如权利要求1所述一种检测基因编辑靶点切割效率的方法，其特征在于：所述哺乳动物细胞为人胚肾细胞HEK293及其衍生细胞、人宫颈癌细胞Hela；所述昆虫细胞为昆虫细胞SF9。

7.如权利要求1所述一种检测基因编辑靶点切割效率的方法，其特征在于：所述将含有基因编辑靶点的移码突变的报告基因转入细胞的方法为：化学转染法、电击转染法、基因枪转染法、病毒转染法中的一种或组合。

8.如权利要求1所述一种检测基因编辑靶点切割效率的方法，其特征在于：所述内切核酸酶为锌指核酸酶(ZFNs，zinc finger nucleases)、转录激活子样效因子介导核酸酶(TALENs，transcription activator-like effector nucleases)，以及CRISPR/Cas9核酸酶，其具有：

1)能识别一段DNA序列即基因编辑靶点序列，上述基因编辑靶点序列能够人工设计和改变；

2)能定点切割DNA。

9.如权利要求7所述一种检测基因编辑靶点切割效率的方法，其特征在于：所述内切核酸酶转入细胞形式为核酸酶表达载体、核酸酶表达病毒、核酸酶的编码RNA、核酸酶蛋白以及核酸酶/RNA复合物中的一种。

10.如权利要求1所述一种检测基因编辑靶点切割效率的方法，其特征在于：所述步骤(2)和(3)同时进行。