[发明专利]一种增强CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的方法

权利要求书

1.一种增强CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的方法，其特征在于，该方法包括：

利用U₃表达盒与U_6a表达盒连接的构造工序、基于U₃表达盒和U_6a连接生成的产物与MH质粒连接的重组工序以及重组后的产物导入到大肠杆菌中的工序，其中，利用U₃表达盒与U_6a表达盒连接的构造工序的具体步骤为：

采用Overlapping PCR法分别得到U₃表达盒SEQ ID NO：2片段和U_6a表达盒SEQ ID NO：3片段,并将U₃表达盒和U_6a表达盒连接起来。包括Overlapping PCR法的三个反应体系：PCR1、PCR2、PCR3，PCR1的上下游引物分别为：U-F、gRNA-R；PCR2的上游引物为B1’-M、B2’-M，下游引物为B2-M、BL-M；PCR3的引物为U₃’、U_6a’，所述引物序列为：

B1’-M：5’-caacgcttctgtttcgcaagGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’，

B2-M：5’-cgagcccaagacactcctctGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3’，

B2’-M：5’-agaggagtgtcttgggctcgCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’，

BL-M：5’-TCGATGTTGACGAAGCGAGTCCATCCACTCCAAGCTCTTG-3’，

U₃’：5’-TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAcaacgcttctgtttcgcaag-3’，

U_6a’：5’-AGCGTGggtctcGaccgACGCGTTCGATGTTGACGAAGCGAGT-3’；

PCR1:将靶点序列引入到启动子的下游和gRNA序列的上游，此轮PCR包括四个PCR反应；

PCR2:将启动子片段和gRNA片段连接在一起，得到U₃表达盒和U_6a表达盒，此轮PCR包括两个PCR反应；

PCR3:将U₃和U_6a表达盒产物连接起来，同时使U₃片段的5’端和U_6a片段的3’端带上BsaⅠ酶切位点，此轮PCR包括一个PCR反应。

2.根据权利要求1所述的一种增强CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的方法，其特征在于：在利用U₃表达盒与U_6a表达盒连接的构造工序前，还具有对质粒的定点工序。

3.根据权利要求2所述的一种增强CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的方法，其特征在于：每完成一个反应体系进行一次电泳检测。

4.根据权利要求1所述的一种增强CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的方法，其特征在于：所述限制性内切酶为KOD FX高保真酶。

5.根据权利要求1所述的一种增强CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的方法，其特征在于：基于U₃表达盒和U_6a连接生成的产物与MH质粒连接的重组工序为对U₃表达盒与U_6a表达盒连接的产物进行纯化，再通过酶切使U₃表达盒与U_6a表达盒连接的产物与MH质粒分别露出互补的粘性末端，酶切后再利用天根通用型DNA纯化回收试剂盒对U₃表达盒与U_6a表达盒连接的产物与MH质粒进行纯化，最后通过T₄连接酶将露出互补粘性末端的U₃表达盒与U_6a表达盒连接的产物和MH质粒连接起来。