[发明专利]一种融合蛋白及其设计方法

说明书

本发明公开一种融合蛋白及其设计方法。本发明所述设计方法是将具有DNA结合功能的重组辅助蛋白与具有DNA切割功能的蛋白融合；在具有DNA切割功能的融合蛋白切割的同时，重组辅助蛋白在切割位点附近提供DNA重组修复模板，招募重组修复酶，从而大幅地提高了重组修复效率。本发明的优点是重组修复效率提高。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说是一种融合蛋白及其设计方法。

背景技术

Cas9基因编辑技术已经广泛应用于各种生物以及离体培养的细胞的基因编辑。目前常规的方法为Cas9蛋白对基因组DNA定点切割后，通常由生物或者细胞自身的修复系统完成对DNA断裂点的修复。修复方法有不精确的邻端连接修复和精确的重组修复。在动物细胞中，基因组DNA断裂后的修复方式以邻端连接修复为主，重组修复的比例很少，造成重组基因编辑的效率低，需要筛选大量克隆才能得到正确编辑的细胞。

因此需要一种Cas9融合蛋白以及设计类似蛋白的方法。设计出的类似蛋白采用将具有DNA结合功能的重组辅助蛋白与具有DNA切割功能的Cas9蛋白融合。在Cas9切割的同时，重组辅助蛋白在切割位点附近提供DNA重组修复模板，招募重组修复酶，从而极大地提高了重组修复效率。

融合蛋白技术是为获得大量标准融合蛋白而进行的有目的性的基因融合和蛋白表达方法，利用融合蛋白技术，可构建和表达具有多种功能的新型目的蛋白。

发明内容

本发明的一个目的在于提出一类融合蛋白，另一个目的在于提出一种融合蛋白的设计方法。本发明采用将具有特异性DNA切割功能的Cas9蛋白与具有DNA 结合功能的重组辅助蛋白融合。在Cas9切割的同时，重组辅助蛋白在切割位点附近提供DNA重组修复模板，招募重组修复酶，从而极大地提高了重组修复效率。

为实现上述目的，本发明所述一种融合蛋白由两个蛋白功能域连接组成；所述两个蛋白功能域分别为具有特异性DNA切割功能的蛋白功能域和具有DNA 结合功能的重组辅助蛋白功能域。

所述两个蛋白功能域通过多肽、化学键、配体亲和连接或者其他物理、化学方法连接组成。

所述在具有特异性DNA切割功能的蛋白功能域的氮端或者碳端连接具有DNA 结合功能的重组辅助蛋白功能域。

所述具有特异性DNA切割功能的蛋白功能域为具有可编程、特异性DNA切割功能的蛋白功能域，所述具有特异性DNA切割功能的蛋白功能域为Cas9蛋白、 Cpf1蛋白，及其变体中的一种。

所述具有DNA结合功能的重组辅助蛋白功能域为具有DNA结合功能的重组修复辅助蛋白功能域或者具有DNA结合功能的蛋白功能域，具有DNA结合功能的重组辅助蛋白功能域为Rad51蛋白、Rad51同源蛋白、Rad52蛋白、Rad52同源蛋白、RecA蛋白、RecA同源蛋白中的一种。

所述同源蛋白为氨基酸序列具有明显的相似性，在不同生物体或同一机体内行使相同或相似功能的蛋白质。

所述的一种融合蛋白设计方法，在有可编程、特异性DNA切割功能的蛋白域的氮端或者碳端添加具有DNA结合功能的重组修复辅助蛋白或者其DNA结合功能的重组蛋白域。

所述本发明方法设计出的融合蛋白通过将该融合蛋白与重组模板DNA、特异性引导RNA一起转入细胞或者生物体发挥作用。

所述本发明方法设计出的融合蛋白该融合蛋白的应用包括细胞或者生物体的基因组编辑，包括且不限于基因敲除、基因敲入以基因定点突变。

所述的一种融合蛋白设计方法，实现步骤如下：

1、融合蛋白由具有特异性DNA切割功能的蛋白功能域和具有DNA结合功能的重组辅助蛋白功能域组成；

2、两个蛋白功能域之间由多肽、化学键、配体受体亲和连接；