[发明专利]一种靶向CD45的打靶载体及其整合至CD45外显子1位点的方法和应用

权利要求书

1.一种靶向CD45的打靶载体，其特征在于，所述打靶载体包含与CD45基因 5’端和3’端同源的5’端同源臂和3’端同源臂，以及在5’端同源臂和3’端同源臂之间的外源基因，真核细胞启动子，原核细胞启动子和筛选标志物。

2.根据权利要求1所述的一种靶向CD45的打靶载体，其特征在于，所述打靶载体靶向整合外源基因至CD45基因位点，所述基因位点范围位于小鼠一号染色体138062859-138175756之间或人一号染色体198638968-198757476之间。

3.根据权利要1所述的一种靶向CD45的打靶载体，其特征在于，所述打靶载体包含从左到右依次为5’端同源臂、IRES基因、外源基因、真核细胞启动子，原核细胞启动子、筛选标志物和3’端同源臂的这部分序列。

4.根据权利要3所述的一种靶向CD45的打靶载体，其特征在于，所述外源基因为可替换的，包括但不限于选用DTR基因。

5.根据权利要求4所述的一种靶向CD45的打靶载体，其特征在于，所述5’端同源臂的序列为SEQ ID NO.3，所述3’端同源臂的序列为SEQ ID NO.13。

6.根据权利要求5所述的一种靶向CD45的打靶载体，其特征在于，所述打靶载体的序列如SEQ ID NO.14所示。

7.如权利要求6所述的靶向CD45的打靶载体的构建方法，包括如下步骤：

(1) 以RP23-180D23 BAC DNA为模板，利用序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物进PCR，扩增出序列如SEQ ID NO.3所示的基因片段CD45 的5’端同源臂；

(2) 将目的基因片段CD45 5HA利用酶切位点KpnI、SalI克隆至带阳性选择标记的载体pL451-targeted-empty，得到中间载体pL451-CD45 5HA-PEN；

(3) 以pLVX-EF1α-IRES-mCherry 质粒为模板，利用序列如SEQ ID NO.4所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.5所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQ ID NO.6所示的基因片段IRES；以pIRES-proHB EGF WT 质粒为模板，利用序列如SEQ ID NO.7所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.8所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQ ID NO.9所示的基因片段DTR；Overlap PCR得到序列如SEQ ID NO.10所示的融合基因片段IRES-DTR；

(4) 将目的基因片段IRES-DTR利用酶切位点SalI、EcoRI克隆至中间载体pL451-CD455HA-PEN，得到中间载体pL451-CD45 5HA-IRES-DTR-PEN；

(5) 以RP23-180D23 BAC DNA为模板，利用序列如SEQ ID NO.11所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.12所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQ ID NO.13所示的基因片段CD45 的3’端同源臂；

(6) 将目的基因片段CD45 3HA利用酶切位点BamHI、NotI克隆至中间载体pL451-CD455HA-IRES-DTR-PEN，得到序列如SEQ ID NO.14所示的打靶载体PL451-loxP IRES-DTR CD453HA 5HA。