[发明专利]一种模拟结肠环境的小型发酵系统及其发酵方法

权利要求书

1.一种模拟结肠环境的小型发酵系统，其特征在于包括管路连接的补料瓶（1）、发酵主体和样品收集装置，所述补料瓶（1）上设有进气口（2），所述发酵主体包括管路依次连接的第一发酵支口试管（4）、第二发酵支口试管（5）和第三发酵支口试管（6），所述第一发酵支口试管（4）、第二发酵支口试管（5）和第三发酵支口试管（6）上均设有气体收集口（10），所述样品收集装置包括第一样品收集器（7）、第二样品收集器（8）和第三样品收集器（9），所述补料瓶（1）与第一发酵支口试管（4）之间的管路、第一发酵支口试管（4）和第二发酵支口试管（5）之间的管路、第二发酵支口试管（5）和第三发酵支口试管（6）之间的管路以及第三发酵支口试管（6）与第三样品收集器（9）之间的管路上均设有蠕动泵（3）。

2.如权利要求1所述的一种模拟结肠环境的小型发酵系统，其特征在于所述第一发酵支口试管（4）右侧的蠕动泵（3）的右侧设有三通阀（11），分别连接第一样品收集器（7）和第二发酵支口试管（5），所述第二发酵支口试管（5）右侧的蠕动泵（3）的右侧同样设有三通阀（11），分别连接第二样品收集器（8）和第三发酵支口试管（6）。

3.利用权利要求1或2所述的小型发酵系统模拟结肠环境发酵的方法，其特征在于包括以下步骤：

（Ⅰ）对补料瓶（1）、发酵主体、样品收集装置和新鲜肠道培养基进行灭菌处理，备用；

（Ⅱ）制备粪便提取液，备用；

（Ⅲ）将恒温摇床打开，设定转速110r/min，温度37℃，预热备用；

（Ⅳ）在超净台内将经步骤（Ⅰ）灭菌后的模拟结肠环境的小型发酵系统搭建好，使用第一发酵支口试管（4）模拟升结肠，第二发酵支口试管（5）模拟横结肠，第三支口发酵试管（6）模拟降结肠，在每支发酵支口试管中添加步骤（Ⅱ）得到的粪便提取液与经步骤（Ⅰ）灭菌后的新鲜肠道培养基质量比为1：9，采用0.1M NaOH和0.1M HCl调节模拟升结肠、横结肠和降结肠的发酵支口试管中PH分别为5.8、6.2和6.8，同时在补料瓶（1）中添加100ml经步骤（Ⅰ）灭菌的新鲜肠道培养基后，将发酵系统密封，再将补料瓶（1）与惰性气体钢瓶相连，打开惰性气体钢瓶和发酵系统中的各蠕动泵（3），向发酵系统中通惰性气体除氧10min；

（Ⅴ）除氧结束后，在各气体收集口（10）处连接气体收集袋，最后将该发酵系统放入经步骤（Ⅲ）预热的恒温摇床中进行发酵反应，条件为：每12h进行一次通惰性气体除氧10min，样品收集装置中液体样品每24h取一次，气体收集袋每24h更换一次，补料方式为流加补料，发酵处理时间为7d。

4.如权利要求3所述的一种模拟结肠环境的发酵方法，其特征在于所述步骤（Ⅰ）中灭菌处理方法为：高压蒸汽灭菌，条件为121℃，15min。

5.如权利要求3所述的一种模拟结肠环境的发酵方法，其特征在于所述步骤（Ⅱ）中粪便提取液的制备方法为：粪便由无肠道疾病，且半年内没有使用过抗生素的20-25岁健康青年提供，捐献者使用一次性无菌采样器收集好粪便后，立即转入在厌氧操作箱，以防厌氧菌接触空气死亡，称取10g粪便与无菌容器中，加入80 mL无菌pH6.8的PBS缓冲液，充分搅拌悬浮后，用无菌三层纱布过滤掉固体颗粒，立即置于厌氧环境中备用。

6.如权利要求3所述的一种模拟结肠环境的发酵方法，其特征在于所述步骤（Ⅲ）中模拟升结肠和降结肠的第一发酵支口试管（4）和第三发酵支口试管（6）中均添加粪便提取液3mL，新鲜肠道培养基27 mL，模拟横结肠的第二发酵支口试管（5）中添加粪便提取液4mL，新鲜肠道培养基36 mL。

7.如权利要求3所述的一种模拟结肠环境的发酵方法，其特征在于所述步骤（Ⅴ）中所述流加补料的流速由蠕动泵（3）控制。