[发明专利]CS/HPMCP纳米微粒在口服疫苗递送中的应用

说明书

本发明公开了CS/HPMCP纳米微粒在口服疫苗递送中的应用，属于动物病毒学和动物基因工程技术领域。为了检测CS/HPMCP纳米微粒口服递送的免疫效力，本发明选取猪流行性腹泻病毒作为试验对象；本发明通过大肠杆菌表达系统表达COE蛋白，进一步通过离子交联方法制备了载有COE的CS/HPMCP纳米颗粒，并且评估了给小鼠口服载有COE的CS/HPMCP纳米微粒后，小鼠的体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫；旨在为研发口服型纳米微粒佐剂提供有力的技术支持，同时为PEDV口服型亚单位疫苗的研究奠定前期基础。

技术领域

本发明涉及动物病毒学和动物基因工程技术领域，更具体的说是涉及CS/HPMCP纳米微粒在口服疫苗递送中的应用。

背景技术

壳聚糖(CS)是甲壳素的部分脱乙酰化形式，由葡萄糖胺和N-乙酰氨基葡萄糖单体通过β-(1-4)糖苷键连接形成，是一种线性聚合物。甲壳素存在于甲壳类，昆虫和真菌细胞壁的外骨骼中，是自然界中仅次于纤维素的第二大最丰富的多糖。由于其极小的毒性，良好的生物降解性，优异的生物相容性，壳聚糖和壳聚糖衍生物已被广泛应用在抗肿瘤、伤口敷料、化妆品、食品、组织工程和眼科等领域。此外，由于CS的阳离子特性，粘膜吸附特性，免疫刺激特性和瞬时打开上皮紧密连接的能力，其还被用来通过粘膜途径递送重组蛋白。为了进一步提高CS的有效性，CS通常以纳米颗粒的形式应用于药物和疫苗的递送，因为基于纳米颗粒的输送系统具有显着的优势，例如可以保护封装的抗原免于降解、控制释放、增强抗原呈递和引发抗原有效的交叉呈递，从而引发CD4⁺和CD8⁺T细胞免疫反应。离子交联是制备壳聚糖纳米粒子的最常用方法，而三聚磷酸盐(tripolyphosphate，TPP)是最常用的交联剂。此外，羟丙甲纤维素邻苯二甲酸酯(hydroxypropyl methylcellulose phthalate，HPMCP)是一种被食品和药物管理局(FDA)批准用于人类的肠溶性生物降解材料，也是另一种交联剂。该物质是制药行业广泛使用的肠溶包衣赋形剂之一，仅在PH5.5时才完全溶解。众所周知，胃肠道的pH值如下：胃(pH2.0-4.0)，十二指肠(pH5.5)，空肠(pH6.0)和回肠(pH7.2-8.0)。因此，当HPMCP用于口服递送蛋白质时，它可以减少胃中蛋白质的降解并增加肠道中蛋白质的吸收。当用HPMCP代替TPP作为交联剂时，CS纳米颗粒表现出更优异的性能，例如增加回肠中纳米颗粒的粘膜吸附性以及酸稳定性。但是该纳米微粒通常用于口服递送胰岛素和肝素，很少被用于蛋白质或疫苗的口服递送，更没有人系统地研究影响CS/HPMCP纳米微粒形成的因素。

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种猪易感的急性高度接触性传染性肠道疾病。PEDV主要感染小肠上皮细胞并引起绒毛萎缩，从而导致7-10天大的乳仔猪严重腹泻，呕吐，脱水，厌食和高死亡率。PEDV的刺突(S)蛋白和S蛋白的中和表位区域(COE)是开发抗PEDV亚单位疫苗的主要候选对象。此外，通过粘膜免疫产生的初乳和牛奶中的PEDV特异性分泌型IgA(SIgA)抗体对于预防PEDV的入侵至关重要。并且，通过粘膜途径递送的疫苗比通过肌肉内途径或皮下注射免疫的传统PEDV灭活和减毒疫苗能更有效地诱导粘膜免疫。然而，妊娠母猪的口服疫苗面临几个挑战，即疫苗中的有效成分可能会被胃肠道中的胃酸，胃蛋白酶和胰蛋白酶降解，而这将使得口服递送的疫苗无法引发针对PEDV感染的有效粘膜免疫反应。

因此，提供CS/HPMCP纳米微粒在口服疫苗递送中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了CS/HPMCP纳米微粒在口服疫苗递送中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

CS/HPMCP纳米微粒在口服疫苗递送中的应用，具体步骤如下：

(1)构建目的基因原核表达载体，经诱导表达纯化，获得纯化的目的蛋白；