[发明专利]快速鉴别猫肠道冠状病毒和猫传染性腹膜炎病毒的HRM引物对、试剂盒及方法

说明书

本发明提供一种快速鉴别猫肠道冠状病毒和猫传染性腹膜炎病毒的HRM引物对、试剂盒及方法，属于分子生物学检测技术领域。本发明HRM引物对根据猫冠状病毒FCOV全长基因29 000bp至29 500bp之间的序列设计得到的。进行一次反应即可通过不同形状熔解曲线同时鉴定区分FECV和FIPV，为疾病的早期诊断及防控提供技术支持。

技术领域

本发明涉及一种用于快速鉴别猫肠道冠状病毒和猫传染性腹膜炎病毒的HRM引物对、试剂盒及方法，属于分子生物学检测技术领域。

背景技术

猫冠状病毒(Feline coronavirus，FCoV)为不分节段、单股正链RNA病毒，属于尼多病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、α冠状病毒属(Alphacoronavirus)。FCoV有猫肠道冠状病毒(Feline enteric coronavirus，FECV)和猫传染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis viruses，FIPV)两个生物型。虽然大部分感染FCoV的猫患轻微肠炎或无症状，但仍有12％的猫会发展成为猫传染性腹膜炎(FIP)，而FIP致死率高。

现有检测FECV和FCoV的实验方法主要是PCR法，包括普通PCR和荧光定量PCR，还有间接免疫荧光法和ELISA方法。PCR技术由于检测灵敏度高，适用范围广，操作简便等原因应用广泛。但PCR检测技术程序复杂、需要精密的仪器、检测时间较长，不利于非实验室环境下现场检测以及基层实验室的推广应用。

高分辨率熔解曲线(High-resolution melting，HRM)是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因突变扫描和基因分型的遗传学分型方法，其基本原理是双链核苷酸(double strand DNA，dsDNA)的热稳定性受其长度和碱基组成的影响，序列变化会导致升温过程中dsDNA解链行为的改变，所用的饱和荧光染料只能嵌入并结合到dsDNA上，因此利用实时荧光PCR技术，通过实时检测dsDNA熔解过程中荧光信号值的变化，就能以生成不同形状熔解曲线的方式将PCR产物中存在的差异直观地展示出来。其敏感性极高、无需使用序列特异性探针就可以检测出单个碱基的差异、PCR产物无需后处理(如酶切、电泳等)，可实现真正的闭管操作从而降低污染风险，已发展成为SNP基因分型、点突变筛查、物种鉴别等的重要手段。

目前，还没有用HRM方法鉴别FECV和FIPV的相关报道。因此，建立猫肠道冠状病毒和猫传染性腹膜炎病毒的HRM检测方法很有必要。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供一种快速鉴别猫肠道冠状病毒和猫传染性腹膜炎病毒的HRM引物对、试剂盒及方法。

本发明选取特定基因序列来设计一对HRM引物，通过不同形状熔解曲线同时鉴定区分FECV和FIPV，为疾病的早期诊断及防控提供技术支持。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种快速鉴别猫肠道冠状病毒和猫传染性腹膜炎病毒的HRM引物对，所述引物对上、下游引物序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示：

FECV-FIPV-F:5′-CTATGTGAAGTACTGTCCAC-3′(SEQ ID No.1)；

FECV-FIPV-R:5′-GTGAGGTCTGTCGAAGACCT-3′(SEQ ID No.2)。

所述引物对根据猫冠状病毒FCOV全长基因29 000bp至29 500bp之间的序列设计得到的。

本发明还提供一种快速鉴别猫肠道冠状病毒和猫传染性腹膜炎病毒的HRM试剂盒，包含上述的引物对。

所述的HRM试剂盒，还包括其他HRM反应所需试剂：酶、荧光染料、Buffer等；