[发明专利]一种来自丝状真菌粗糙脉胞菌的新型诱导型启动子及其应用

说明书

本发明针对目前工业上甾体生物转化羟化反应投料量偏低的问题，提供一种诱导型启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。该启动子能够用于构建粗糙脉孢工程菌，为构建高效催化甾体化合物羟化反应的基因工程菌株奠定坚实的基础，对于提高甾体化合物的生物转化效率具有重要的意义。

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种新颖的运用于构建粗糙脉孢工程菌启动子。

背景技术

甾体激素类药物是目前仅次于抗生素的第二大类药物，在临床上具有极其重要的医药价值，在维持生命、调节生理功能、免疫功能、机体生长、皮肤病治疗及生育控制等方面具有良好的作用。化学合成在甾体化合物的研究和生产过程中仍具有举足轻重的地位，而在甾体激素药物的生产中，微生物转化技术已成为许多甾体化合物或其中间体合成路线中不可缺少的关键技术。大量事实表明，甾体化合物工业是将化学合成技术和生物技术相结合应用于工业生产的一个典范。

微生物对甾体化合物的转化反应多种多样，比较典型的微生物转化反应主要有羟基化、脱氢、边链降解等。其中，甾体化合物生物催化羟基化尤为重要。目前，甾体化合物的生物催化羟基化因其高效性，已广泛应用到抗炎药、免疫抑制剂、促孕剂、利尿剂、同化剂以及避孕药的生产中。

细菌和真菌都可以催化甾体的羟基化反应，但目前成功应用于工业生产的大多为丝状真菌如曲霉和青霉等。在甾体化合物生物催化过程中，菌体自身的催化活性直接影响产物的转化效率。随着分子生物学的发展，构建具有高转化能力的基因工程菌株以提高甾体转化效率成为近年来的研究热点。丝状真菌中催化羟基化反应的羟基化酶属于P450酶系，但目前对于参与反应的羟化酶研究相对较少，国内外相关羟化酶启动子也未见报道，其表达调控机制更不明确。

采用粗糙脉孢菌催化甾体化合物脱氧可的松醋酸酯的C11β位羟基化反应，合成氢化可的松(如图1)。与化学合成方法相比，其反应条件较温和，具有较高的区域选择性，立体选择性和化学选择性，易于纯化，且转化率高，生产成本低，对环境友好。研究证明，粗糙脉孢菌(FGSC9717)是羟化效果优良的候选菌株。已有的研究证实丝状真菌的甾体C11β-羟化酶在转录水平上受甾体底物诱导，但有关羟化酶的诱导机制及其相关基因尚未见文献报道。

因此，对于来源于P450羟化酶基因启动子的研究，将为阐述羟化酶的生物催化反应分子机制奠定良好基础，同时也为构建下一代高效工程菌提供了关键的基因资源，对于甾体药物生物催化羟基化的高效生产具有重要的意义。

发明内容：

本发明的目的是针对目前工业上甾体生物转化羟化反应转化效率偏低的问题，为构建粗糙脉孢工程菌提供一种诱导型启动子Pshn，该启动子能够诱导P450羟化酶基因CYP5311B2(简称为CYP-7)的表达，为构建高效催化甾体化合物羟化反应的基因工程菌株奠定坚实的基础，对于提高甾体化合物的生物转化效率具有重要的意义。

本发明所述粗糙脉孢菌启动子Pshn来源于粗糙脉孢菌FGSC9717，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明所述粗糙脉孢菌启动子Pshn也可以是能与SEQ ID NO：1所示序列杂交并且具有启动子功能的核苷酸序列。

含有本发明所述粗糙脉孢菌启动子Pshn的表达盒、表达载体、重组载体或宿主细胞也属于本发明的保护范围。

基因扩增含有本发明所述粗糙脉孢菌启动子Pshn DNA全长或部分片段的引物序列也属于本发明的保护范围。

本发明所述粗糙脉孢菌启动子Pshn，可用于甾体化合物羟化酶基因的诱导表达。

本发明所述粗糙脉孢菌启动子Pshn，可用于丝状真菌粗糙脉孢菌中甾体化合物羟化酶基因的诱导表达。