[发明专利]层出镰刀菌SSR分子标记及其应用

权利要求书

1.层出镰刀菌SSR分子标记，其特征在于包括多态性丰富的12个含不同简单序列重复单元的SSR分子标记，具体包括FP03，核苷酸序列为SEQ ID NO.1；FP08，核苷酸序列为SEQID NO.2；FP13，核苷酸序列为SEQ ID NO.3；FP21，核苷酸序列为SEQ ID NO.4；FP24，核苷酸序列为SEQ ID NO.5；FP26，核苷酸序列为SEQ ID NO.6；FP31，核苷酸序列为SEQ ID NO.7；FP32，核苷酸序列为SEQ ID NO.8；FP35，核苷酸序列为SEQ ID NO.9；FP43，核苷酸序列为SEQ ID NO.10；FP48，核苷酸序列为SEQ ID NO.11；FP51，核苷酸序列为SEQ ID NO.12。

2.如权利要求1所述的层出镰刀菌SSR分子标记，其特征在于用于扩增所述12个含不同简单序列重复单元的SSR分子标记的12对引物包括：扩增FP03的引物核苷酸序列为SEQ IDNO.13和SEQ ID NO.14，扩增FP08的引物核苷酸序列为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16，扩增FP13的引物核苷酸序列为SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18，扩增FP21的引物核苷酸序列为SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20，扩增FP24的引物核苷酸序列为SEQ ID NO.21和SEQ IDNO.22，扩增FP26的引物核苷酸序列为SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24，扩增FP31的引物核苷酸序列为SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26，扩增FP32的引物核苷酸序列为SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28，扩增FP35的引物核苷酸序列为SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30，扩增FP43的引物核苷酸序列SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32，扩增FP48的引物核苷酸序列为SEQ IDNO.33和SEQ ID NO.34，扩增FP51的引物核苷酸序列为SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36。

3.如权利要求1或2所述的SSR分子标记在层出镰刀菌遗传多样性分析中的应用。

4.如权利要求3所述的SSR分子标记在层出镰刀菌遗传多样性分析中的应用，包括以下步骤：

（1）对层出镰刀菌进行采集、分离与鉴定；

（2）提取层出镰刀菌菌株的基因组DNA；

（3）对步骤（2）得到的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

（4）SSR基因分型：将步骤（3）得到的PCR扩增产物稀释30倍后，进行变性，上样至全自动基因测序仪进行片段分析，使用软件GeneMapper v3.25进行数据读取，根据分离片段的大小决定基因型；

（5）遗传多样性分析。

5.如权利要求4所述的SSR分子标记在层出镰刀菌遗传多样性分析中的应用，其特征在于所述步骤（3）中PCR反应体系为：50 ng/μL的模板DNA 1 μL，25 mM的MgCl2 2.5 μL，2.5mM dNTPs 1μL，10 μM的正向、反向引物各1μL，5 U/μL的DNA Taq酶0.2 μL，10×PCR buffer2.5 μL，去离子水补至25μL，所述引物的正向5’端带有蓝色6-FAM或绿色HEX的特异性荧光标记用于扩增目的条带的大小，PCR扩增程序为：98℃预变性3min，98℃变性10s，55℃退火20s，72℃延伸30s，共35个循环，72℃延伸10min。

6.如权利要求4所述的SSR分子标记在层出镰刀菌遗传多样性分析中的应用，其特征在于所述步骤（5）遗传多样性分析的方法为：利用POPGENE version 1.32计算观察等位基因数Na、有效等位基因数Ne、Shannon’s多样性指数I、观察杂合度Ho、期望杂合度He、群体间Nei’s遗传距离D和遗传相似度I，利用Alequin3.1软件的分子变异方差分析AMOVA，计算群体间、群体内个体间以及个体间不同变异层次所占总变异的百分比，统计方差分量及贡献率，明确引起群体总变异的主要来源，计算群体间的遗传分化系数FST，根据FST =1/（4Nm+1），估算基因流Nm，基于Nei’s遗传距离，利用MEGA 6软件构建群体的非加权组平均法UPGMA聚类图，利用Structure V2.3.4软件的贝叶斯聚类法进行群体间遗传结构分析，所生成的种群遗传结构图用DISTRUCT软件绘制而成。