[发明专利]一种对柑橘砂皮病有抑制作用的枯草芽孢杆菌及其筛选方法

说明书

本发明公开了一种对柑橘砂皮病有抑制作用的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株、筛选方法和最佳发酵条件，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.17205。该菌株的发酵液能安全、无毒、有效的防治柑橘砂皮病（Diaporthe citri），经过田间试验该菌的发酵液稀释30倍的发酵液对柑橘砂皮病的防治效果为79.09%，稀释50倍发酵液对柑橘砂皮病的防治效果为68.97%。同时该菌具有广谱抑菌性，对花生白绢病菌、花生冠腐病菌、水稻纹枯病菌、草莓灰霉病菌也有一定的抑制作用。目前国内还没有将枯草芽孢杆菌用柑橘砂皮病防治的报道。因此，该拮抗菌株具有很好的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种对柑橘砂皮病菌有抑制作用的新菌株及其筛选方法、和最适发酵条件优化。

背景技术

柑橘砂皮病的病原有性态为柑橘间座壳(Diaporth citri)，经Wolf等人分离发现，病原无性态为柑橘拟茎点霉(Phomopsis citri),由Fawsett等人分离发现，病原菌分生孢子器在表皮下形成，球形、椭圆形或不规则形，具有瘤状孔口，分生孢子无色透明，有两种形态：α型，孢子呈椭圆形或纺锤形，单孢，内一般含2个油球，有时含多个油球，易萌发；β型，正直细长或弯曲呈钩状，无油球，该类型孢子不易萌发。一般以α型孢子居多，β型孢子较少见。病原菌最适生长温度为25℃左右，高于35℃或低于20℃会导致菌丝生长缓慢，分生孢子在5℃～35℃均可萌发；在PDA培养基上培养，菌丝白色密集，呈放射状向四周生长，培养14d左右产生子实体，培养基表面出现单独或成堆的黑色分生孢子座，上着生分生孢子器，分生孢子器上产生白色或淡黄色滴状物即为分生孢子。

该病为真菌寄生性病害，由于绝大部分柑橘果树枝叶带刺，在雨季刮大风时，树枝被风刮动，互相之间摩擦会造成伤口，加上大量降雨也易导致孢子大量繁殖，孢子萌发后在空气中四处飞散会导致病害的大范围传播。病原菌为弱寄生菌，通常在树势衰弱时或有伤口时侵染柑橘，以菌丝体或分生孢子器在病叶、病枝上越冬，病株上的分生孢子器在环境适宜的情况下可以产生大量分生孢子，来年条件合适时进行新一轮的侵染。有人指出，这些黑点的出现，是柑橘作为寄主本身做出防卫反应的产物。也有研究指出，柑橘砂皮的发病条件也与柑橘的种类有一定关系。

目前来看，化学药剂是防治柑橘砂皮病的主要方法。但是长期单一使用某一种化学药剂，容易产生抗药性，影响防治效果。由于柑橘砂皮病的特性，需要在一年内多次施药进行防治，化学药剂大量使用对环境造成污染以及对人体健康的潜在危害。因此，筛选出对柑橘砂皮病菌有抑制作用的微生物是防治柑橘砂皮病的最佳途径。

发明内容

针对上述问题，本发明人从湖南省怀化市麻阳县柑橘砂皮病发生的不同橘园采集健康柑橘叶片，分离柑橘叶内生菌，通过稀释平板法获得细菌的单菌落，再采用平板对峙法筛选得到一株对柑橘砂皮病有较好抑制作用的细菌，将该菌命名为M-23，经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。本发明人经过研究发现该菌对人畜无致病性，能安全地用于柑橘砂皮病的生物防治。同时，M-23菌株对水稻纹枯病菌、花生冠腐病菌、花生白绢病菌、草莓灰霉病菌也有一定的抑制作用。

本发明提供的技术方案是：一种对柑橘砂皮病菌有抑制作用的细菌，其是保藏号为CGMCC No.17205的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

本发明所述的细菌M-23(枯草芽孢杆菌，拉丁名：Bacillus subtilis)已于2019年1月16日为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC所保藏(保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏号为CGMCC No.17205，经检测存活。

同时，本发明还提供所述对柑橘砂皮病菌有抑制作用的细菌的筛选方法，其步骤如下：