[发明专利]基于基因组重排技术的共生菌丝球秸秆沼气制备方法

权利要求书

1.基于基因组重排技术的共生菌丝球秸秆沼气制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：基因重排技术构建高效降解木质素菌株；

步骤二：基因重排技术构建高效降解纤维素、半纤维素菌株；

步骤三：制备高效降解秸秆共生菌丝球；

步骤四：将步骤三获得的共生菌丝球用于制备秸秆沼气。

2.根据权利要求1所述的基于基因组重排技术的共生菌丝球秸秆沼气制备方法，其特征在于，所述步骤一中，用于构建降解木质素菌株的菌种为云芝栓孔菌5.1500，黄孢原毛平革菌5.776；所述步骤二中，用于构建降解纤维素、半纤维素菌株的菌种为拟康氏木霉3.6612，里氏木霉3.3711；所述菌种均保藏于中国科学院微生物研究所。

3.根据权利要求1所述的基于基因组重排技术的共生菌丝球秸秆沼气制备方法，其特征在于，所述步骤一、步骤二还分别包括以下具体步骤：

S1：粉碎机粉碎秸秆，立式压力蒸汽灭菌器湿热灭菌30分钟,灭菌温度为121℃；然后75℃～80℃烘4-6h备用；

S2：菌种活化：溶解冻干菌体，并接种到PDA培养基上进行菌种转接活化；

S3：液体菌种培养：将PDA培养基上的菌种分别接种到液体种子培养基中，控制孢子浓度在1×108个/mL；

S4：采用烘干称重法测定菌株生长曲线，确定菌株对数生长期；

S5：制备菌体的原生质体；

S6：将S5中制备的菌体原生质体进行原生质体灭活；

S7：将S6中灭活后的原生质体进行融合；

S8：融合子检出，然后按照S3中方法制备融合子菌体；

S9：灭菌滤纸过滤S3和S8中制备的孢子悬液和融合子菌体，灭菌水冲洗，按质量比1:2称取S1中秸秆和基础培养基用于接种过滤得到的菌体，测定木质素或纤维素、半纤维素含量指标及相应酶活力，筛选性能最好的融合子；

S10：中常压室温等离子体ARTP诱变S9中获得的融合子；

S11：将步骤S10中诱变得到的菌株进行培养，根据菌落生长状况选择菌株；

S12：将S11中筛选出的菌株按S4到S9操作，测定木质素或纤维素、半纤维素含量指标及相应酶活力，筛选性能最好的融合子；

S13：按S10中方法诱变S12中融合子菌株，然后按S11到S12方法操作，测定木质素或纤维素、半纤维素含量指标及相应酶活力，筛选性能最好的融合子菌株；

S14：重复S13 2-3次，获得遗传稳定的高效降解木质素菌株A或高效降解纤维素、半纤维素菌株B。

4.根据权利要求1或3所述的基于基因组重排技术的共生菌丝球秸秆沼气制备方法，其特征在于，所述步骤三还包括以下具体步骤：

S1：菌悬液的制备：将制备的能高效降解木质素的菌株A和降解纤维素(半纤维素)的菌株B分别用无菌水制成浓度为1×106个/mL(血球计数法测定)的孢子悬液，4℃冰箱保存备用；

S2：共生菌丝球的制备：将S1中制备的菌株A菌悬液和菌株B菌悬液，接入到含菌丝球成球培养液中，摇床振荡培养3～5d，过滤收集菌丝球，放入无菌生理盐水中备用。

5.根据权利要求4所述的基于基因组重排技术的共生菌丝球秸秆沼气制备方法，其特征在于，所述步骤四还包括以下具体步骤：

S1：秸秆经粉碎机粉碎后,立式压力蒸汽灭菌器湿热灭菌30分钟,灭菌温度为121℃；然后75℃～80℃烘4-6h备用；

S2：按质量比1:2称取S1中秸秆和基础培养基于锥形瓶中，灭菌冷却后接种得到的共生菌丝球，25℃～28℃培养5～7d预处理秸秆，然后加入5～6倍体积的污泥在厌氧环境下发酵。

6.根据权利要求4所述的基于基因组重排技术的共生菌丝球秸秆沼气制备方法，其特征在于，所述菌丝球成球培养液由蔗糖18g/L，酒石酸铵2.5g/L，KH2PO42g/L，MgSO4.7H2O2g/L，加蒸馏水配成1000mL，自然pH值，120℃灭菌20min而制成。

7.根据权利要求5所述的基于基因组重排技术的共生菌丝球秸秆沼气制备方法，其特征在于，所述污泥取自沼气池或发酵池，所述发酵的时间为20天。