[发明专利]用于LINE-1的检测引物组及其应用

说明书

本发明公开了用于LINE‑1的检测引物组及其应用，引物组包括如SEQ ID NO.1、2、7和8所述的引物。本发明一些实例的引物组，具有很好的特异性及极佳的扩增效率。可以用于多种肿瘤的早期筛查、复发诊断、治疗监测，具有简便、快捷、准确的优势。

技术领域

本发明涉及基因领域，特别涉及用于LINE-1的检测引物组及其应用。

背景技术

癌症是困扰人类的一大疾病，根据统计数据，2018年全球新增约1810万癌症病例，另有970癌症患者死亡。在中国2018年新发癌症病例约380万，死亡人数约229万，总体癌症发病率上升3.2％左右。癌症已成为我国四大慢性病之一，严重影响人民健康。癌症的早期筛查、诊断能有效的降低癌症死亡率。治疗效果、复发的有效监测能为癌症病人的精准治疗提供可靠参考。目前癌症诊断的金标准是影像学检测。但是影像学检测存在一些局限性：很难在早期发现肿瘤发生，且部分影像学检测存在适应性差〔如肠镜〕、成本较高等缺点。

Cell-free DNA(cfDNA)即游离DNA，是存在于血清、血浆和其它体液(即尿、腹水等)且高度降解的细胞外DNA。主要来源于细胞的凋亡和死亡。当细胞发生癌变时，会释放特异的DNA进入血液，通过检测肿瘤特也cfDNA，可以监测癌症的发生与发展。随着技术的发展循环肿瘤DNA(ctDNA)在肿瘤检测中便捷、快速、无创等优点，表现出很强的优势。

然而目前以ctDNA为标志物的检测方法大多需要检测多个基因，且只能监测一种癌症，导致检测成本居高不下，很难广泛推广，且检测特异性和灵敏度较低。

长散布元件(LINE-1，long interspersed nucleotid element 1，L1)属于中度重复序列，是人类基因组中最丰富的能自主转座的非末端重复序列反转录转座子，约有850000个拷贝，占基因组的17％。典型的L1元件全长为6500kb，包括5’UTR，两个读码框(ORF1和ORF2)，和3’UTR。两个读码框分别编码两种蛋白，具有分子伴侣活性的非特异RNA结合蛋白(40kDa)及具有反转录酶(RT)和核酸内切酶(EN)的活性150kDa的蛋白质，是反转座作用所必须的。LINE-1过表达可以促进细胞增殖，对肿瘤的预后及转移产生影响。LINE-1反转录转座和甲基化状态在临床诊断、预后、疾病监测以及治疗等方面有着潜在的应用价值。

LINE-1与多种肿瘤相关，通过检测LINE-1的表达情况下，可以对多种肿瘤进行筛查。然而LINE-1在人类基因组中虽然存在很多份拷贝，但是由于95％以上的LINE-1 5′端存在缺失，其中有10％LINE-1还存在重排，因此具有序列全长及转座活性的LINE-1非常少见，具体LINE-1上哪些片段可作为肿瘤筛查的检测靶点，需要对LINE-1相关研究做广泛调研，并需要较为大量样品的验证。且单一引物检测效果可能并不具备足够的特异性和灵敏度，两对甚至多对引物结合可能有更好的效果，如何筛选出合适的引物组合是一个难点所在。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种用于LINE-1的检测引物组及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供：

一种用于游离LINE-1检测的引物组，包括以下至少一对引物：

LINE1-S-A引物对，其正向序列为：TGGCACATATACACCATGGAA，反向序列为：TGAGAATGATGGTTTCCAATTTC；

LINE1-L-A引物对，其正向序列为：ACACCTATTCCAAAATTGACCAC，反向序列为：TTCCCTCTACACACTGCTTTGA。

在一些实例中，所述引物组同时包括LINE1-S-A引物对和LINE1-L-A引物对。

本发明的第二个方面，提供：