[发明专利]一种体外大量获得白蜡虫dsRNA的体系构建方法

权利要求书

1.一种体外大量获得白蜡虫dsRNA的体系构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤（1），提取白蜡虫总RNA并反转录为cDNA后进行PCR扩增，扩增产物与L4440载体质粒分别经SacI和SalI双酶切，双酶切后产物利用T4连接酶4℃过夜连接，得到含302a1基因片段的重组质粒302a1-L4440；

步骤（2），将步骤（1）得到的302a1-L4440重组质粒转化进入大肠杆菌感受态细胞HT115（DE3）菌株中，涂布固体培养基筛选单菌落，得到302a1-L4440-HT115菌体；

步骤（3），将步骤（2）获得的302a1-L4440-HT115菌体液体摇床培养至OD₆₀₀=0.38-0.42，加入IPTG诱导，获得含有白蜡虫302a1基因片段的dsRNA菌液；

步骤（4），将步骤（3）得到含有白蜡虫302a1基因片段的dsRNA菌液，浓缩菌液，用于RNA干扰实验。

2.根据权利要求1所述的体外大量获得白蜡虫dsRNA的体系构建方法，其特征在于，所述的白蜡虫总RNA包含中白蜡虫302a1基因的总RNA。

3.根据权利要求1所述的体外大量获得白蜡虫dsRNA的体系构建方法，其特征在于，所述的PCR扩增采用的引物为ECEGT01-F和ECEGT01-R；

ECEGT01-F：5'-atgagctccgctctggtataaattcatttggac-3'（SEQ ID NO.6）；

ECEGT01-R：5'-atgtcgacgcctgttgaatcattatcactccta-3'（SEQ ID NO.7）。

4.根据权利要求1所述的体外大量获得白蜡虫dsRNA的体系构建方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的PCR扩增体系为：

Taq PCR Master Mix(2X, with Red Dye) 25.0μl，

cDNA 3.0μl，

ECEGT01-F 10μM 2.0μl，

ECEGT01-R 10μM 2.0μl，

ddH₂O 18.0μl，

总计 50.0μl；

PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30次循环；72℃延伸5min，4℃保存。

5.根据权利要求1所述的体外大量获得白蜡虫dsRNA的体系构建方法，其特征在于，步骤（1）中，酶切的条件体系为：

SacⅠ 1.0 μl，

SalⅠ 1.0 μl，

NE Buffer(10x) 5.0 μl，

扩增产物或L4440 4.0 μl，

dH₂O 39.0 μl，

总计 50.0 μl；

酶切的时间为10min，温度为37℃。

6.根据权利要求1所述的体外大量获得白蜡虫dsRNA的体系构建方法，其特征在于，连接体系为：

酶切后的扩增产物 4.0ul，

酶切后的L4440 1.0ul，

T4酶 1.0ul，

T4 Buffer 2.5ul，

H₂O 11.5ul，

总计 20.0ul。