[发明专利]黄烷酮-3-羟化酶抗原表位肽及其抗体与应用

说明书

本发明公开了一种黄烷酮‑3‑羟化酶抗原表位肽及其融合蛋白和其特异性抗体，以及抗体的制备方法与应用。所述黄烷酮‑3‑羟化酶抗原表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，该抗原表位肽经修饰后经过固相合成并与载体蛋白偶联得到融合蛋白作为人工合成抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述人工合成抗原免疫动物经分离纯化得到本发明的特异性抗体，本发明制备的多克隆抗体亲和力强、特异性好，灵敏度高、操作简便，可与水稻黄烷酮‑3‑羟化酶发生特异性结合反应，且制备成本低，得率高，为水稻黄烷酮‑3‑羟化酶的相关生理功能研究及鉴定提供了一个重要的工具。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种黄烷酮-3-羟化酶抗原表位肽、融合蛋白、黄烷酮-3-羟化酶特异性抗体及其制备方法与应用。

背景技术

植物体中的类黄酮化合物因具有一定药用价值而备受科学家关注，花色苷是一种水溶性黄酮类化合物，属于类黄酮次生代谢产物，在植物各种器官和组织中均有不同含量的分布，在花色形成、果实着色等过程中起着关键的作用。大量研究证实，黄酮类化合物具有抗氧化、清除自由基、保护心脑血管、抗肿瘤和抗炎症等多种药用价值。花色苷的合成是一个多酶反应途径，其中黄烷酮-3-羟化酶（flavanone 3-hydroxylase，F3H）是多酶生物合成途径中关键酶之一。因此，研究类黄酮合成途径关键酶可以为植物次生代谢物积累机制提供基础生理和分子研究支持，为其药用研究提供基础。

F3H作为黄酮醇、花青素和原花青素合成途径的共有关键酶，是整个类黄酮合成途径枢纽位点。F3H属于依赖型2-酮戊二酸双加氧酶（2-ODD）家族，反应需要依赖铁、分子氧、2-酮戊二酸和抗坏血酸等作为辅助因子，具有底物特异性，其作用是催化柚皮素的C3位羟基化，生成二氢山奈素。F3H以柚皮素为作用底物，参与黄酮和花青素合成代谢途径的调控，是代谢过程中的关键酶。F3H基因最早从金鱼草中分离得到，经过对矮牵牛的分析和研究发现，F3H是一种单体蛋白。目前已陆续从拟南芥、矮牵牛、玉米、甘蓝型油菜、苜蓿、苹果、康乃馨、银杏及苦荞等多种植物中克隆得到F3H基因。

由于蛋白质家族的成员众多，所以对植物中花色苷生物合成关键酶分析鉴定主要运用单向/双向电泳技术和液相色谱联合质谱技术。其鉴定仪器贵鉴定技术过程复杂并且繁琐，而在多克隆抗体制备过程中由于多个抗原决定簇的存在，重组蛋白的表达和纯化过程中不可避免的会掺入一些杂蛋白，制备的抗体仍有可能存在交叉反应，从而影响抗体的特异性。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种黄烷酮-3-羟化酶抗原表位肽、黄烷酮-3-羟化酶特异性抗体及其制备方法与应用，本发明发掘了一种黄烷酮-3-羟化酶抗原表位肽；该抗原表位肽经修饰后经过固相合成并与载体蛋白偶联得到融合蛋白作为人工合成抗原；所述人工合成抗原免疫动物经分离纯化得到本发明的黄烷酮-3-羟化酶特异性抗体，该抗体具有很高的灵敏性。

本发明是这样实现的：

本发明目的之一在于提供一种黄烷酮-3-羟化酶抗原表位肽，其氨基酸序列如SEQID NO：1所示。

所述的黄烷酮-3-羟化酶抗原表位肽可直接通过公司合成得到；或通过构建含有所述氨基酸序列所对应的核苷酸的表达载体，然后将所述表达载体转染进宿主细胞表达得到所述的黄烷酮-3-羟化酶抗原表位肽。

本发明的目的之二在于提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包括所述的黄烷酮-3-羟化酶抗原表位肽和任选的标签序列。

优选地，所述的标签序列为在所述的黄烷酮-3-羟化酶抗原表位肽的C端增加的1个半胱氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

优选地，所述标签序列半胱氨酸Cys上的巯基通过偶联剂偶联有载体蛋白。

更为优选地，所述载体蛋白为钥孔戚血蓝蛋白，所述偶联剂为琥珀酰亚胺-4-环已烷-1-碳酸酯。