[发明专利]一种检测禽呼肠孤病毒的纳米PCR方法、试剂盒及应用

权利要求书

1.一种检测禽呼肠孤病毒的纳米PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括SiO₂/Au/Fe₃O₄纳米粒子、上游引物和下游引物；所述上游引物的序列为SEQ ID No.1所示，所述下游引物的序列为SEQ ID No.2所示；所述SiO₂/Au/Fe₃O₄纳米粒子包括如下制备步骤：

1)1g FeCl₃·6H₂O和0.4g FeSO₄·7H₂O加入到10mL的去离子水中，置于300mL三颈烧瓶中室温下搅拌30min，N₂保护条件下加热至80℃，迅速加入100mL1.0mol/L的氨水，继续反应40min，生成黑色悬浊液，用磁铁分离，收集沉淀，并用二次去离子水反复洗涤五次，再用无水乙醇洗涤两次，直到上清液变澄清，将收集的固体分散到100mL去离子水中，得到Fe₃O₄纳米粒子；

2)0.229g柠檬酸钠溶解在100mL去离子水中，磁性搅拌下加热到80℃，再加入50mL步骤1）得到的Fe₃O₄纳米粒子，然后加入20mL 10mmol/L四氯金酸，80℃下反应15min，最后移走热源，在室温下继续搅拌15min；当酒红色悬浊液冷却至室温后，再次用磁铁分离；最后将收集到的固体分散到50mL去离子水中，得到的Au/Fe₃O₄悬浊液置于4℃下保持备用；

3)取50mL步骤2）得到的Au/Fe₃O₄悬浊液分散在200mL乙醇中，超声10min，搅拌条件下，将1mL NH₃·H₂O滴加到上述混合物中搅拌30min，加入0.027g正硅酸四乙酯，持续搅拌6h，用磁铁分离，收集沉淀，并用二次去离子水反复洗涤五次，70℃真空干燥，称重，最后将收集到的固体分散到去离子水中得到的1mg/mL SiO₂/Au/Fe₃O₄悬浊液置于4℃下保持备用。

2.根据权利要求1所述的检测禽呼肠孤病毒的纳米PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括MgCl₂，10×PCR buffer，dNTP，Taq酶。

3.根据权利要求2所述的检测禽呼肠孤病毒的纳米PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照。

4.一种检测禽呼肠孤病毒的纳米PCR方法，其特征在于，所述方法使用权利要求1中所述的SiO₂/Au/Fe₃O₄纳米粒子、上游引物和下游引物扩增禽呼肠孤病毒的特异性片段，所述方法不包括疾病的诊断和治疗方法。

5.根据权利要求4所述的检测禽呼肠孤病毒的纳米PCR方法，其特征在于，所述纳米PCR的反应体系中，所述上游引物和下游引物添加量为0.4-1.2μL/25μL，和/或所述SiO₂/Au/Fe₃O₄纳米粒子的添加量为0.5-1.5μg/25μL，和/或所述纳米PCR反应退火温度为55℃。

6.根据权利要求5所述的检测禽呼肠孤病毒的纳米PCR方法，其特征在于，所述纳米PCR反应体系中，所述上游引物和下游引物添加量为0.8μL/25μL，和/或所述SiO₂/Au/Fe₃O₄纳米粒子的添加量为0.5μg/25μL。