[发明专利]一种利用不定芽诱导雪胆多倍体植株的方法及其应用

说明书

本发明涉及一种中药材的多倍体培养方法，具体涉及一种利用不定芽诱导雪胆多倍体植株的方法及其应用。具体过程包括，（1）不定芽的无菌培养；2）多倍体诱导；3）嵌合体分离培养；4）多倍体筛选；5）多倍体扩增和6）多倍体生根。本发明采用无菌组织培养的方式进行多倍体育种，能为雪胆多倍体种植短期内提供大量、稳定的雪胆多倍体种苗。本发明利用秋水仙素对雪胆无菌不定芽进行多倍体诱导，后通过形态学鉴定法和染色体压片法筛选并纯化培养获得多倍体雪胆种质，多倍体诱导率为26%。本发明诱导母本雪胆素含量为1.46%的种质产生的多倍体，经两年的种植比较（一般种植周期3～4年），较同期同母本的两倍体组培苗种植的雪胆素含量高0.2%，有效提高了药材的应用价值及药材市场价格。

技术领域

本发明涉及一种中药材的多倍体培养方法，属于植物作物育种及中药材种植领域，特别涉及雪胆的多倍体培养方法及其应用。

背景技术

雪胆为葫芦科雪胆属植物，多年生攀援草本，具膨大块茎，主要分布于亚洲亚热带至温带地区，生于海拔800-3500米的疏林下或灌丛中。整个雪胆属全国共有31种，云南具26种。1977版《中国药典》将曲莲（Hemsleya amabils Diels）及同属数种植物的干燥块根收录入雪胆药材，《中华本草》将中华雪胆（H.chinensis Cogn.ex Forb.et Hemsl）曲莲（H.amabils Diels）以及大籽雪胆（H. macrosperma C.Y.Wu ex C.Y.Wu.ex C.L.Chen）三种雪胆属植物的干燥块根收录入雪胆药材，各地方药材标准均涉及本地所产的雪胆属下品种，而根据各文献的药理、化学成分、资源调查等研究资料显示，雪胆属下各品种的干燥块根均可作为雪胆药材使用。雪胆具清热解毒，利湿消肿，止痛止血的功效，主治咽喉肿痛、牙痛、目赤肿痛，胃痛，痢疾，肠炎，肝炎，尿路感染，前列腺炎，痔疮，子宫颈炎，痈肿疔疮，外伤出血等症。现代医药研究显示，雪胆内含雪胆素（雪胆素甲与雪胆素乙总称）、雪胆皂苷、齐墩果酸等多种活性成分，其中雪胆素为雪胆最具价值及代表性的活性成分，有抑菌作用、抗肿瘤作用、体外抗HIV活性等，且毒性较小，具有“天然抗生素”的美称，但由于受品种及生境的影响，各产地甚至同产地的雪胆药材的雪胆素含量差异极大（百万分之一至百分之一点五），极大的影响了雪胆药效。虽然目前各地方药材标准均只对雪胆素作了定性要求而未有定量指标，但绝大多数制药企业的企业标准均对雪胆素作了定量要求，特别是提取雪胆素或以雪胆素为原料生产中药制剂的相关企业，同时，雪胆素含量也是影响雪胆药材价格的重要指标，即雪胆素含量越高，雪胆价格亦越高。

多倍体普遍存在于自然界中，在生物自身体细胞中具有三个或三个以上的染色体，常见于高等植物中，许多植物在进化的过程都经历了“多倍体化”与“二倍体化”。由于多倍体具有茎叶增大增厚、抗逆性强、次生代谢产物增多等特点，使得多倍体逐渐成为作物育种的重要方式。目前许多重要的粮食作物和经济作物都是多倍体。而在药用植物的育种上，多倍体育种技术的研究及应用极少，但由于多倍体的优良特性，药用植物多倍体人工育种将是药用植物品种改良的重要方式。

发明内容

本发明针对雪胆中雪胆素的应用价值、其含量对药材价格的影响，雪胆药材种植效益等，特利用现代生物育种技术，对雪胆染色体进行加倍，提高了雪胆药材的雪胆素含量以及单株产量。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是，一种利用不定芽诱导雪胆多倍体植株的方法，步骤包括：

1. 无菌不定芽的培养

（1）选取健壮、无病虫害雪胆幼嫩茎段，用自来水冲淋60～90min，后倒干水分，加适量肥皂液，涮洗10～20min后自来水冲洗3～4次至无肥皂液残留，再加2～3滴吐温-80，振摇10～15min，用自来水冲淋30～60min；

（2）转移至超净工作台内，加入75%（v/v）酒精消毒15～20s，无菌水涮洗2～3次，后用饱和漂白粉溶液消毒15～20min，无菌水涮洗3～4次，再加入0.1%升汞溶液振摇5～7min，无菌水涮洗6～8次，用无菌纸吸去外植体表面水分；