[发明专利]一种定量Pichia pastoris细胞残留的核酸检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种定量Pichia pastoris细胞残留的核酸检测试剂盒，本发明可以检测出Pichia pastoris细胞DNA的最低浓度为1fg/μl，在具有非常好的灵敏度同时还具有很好的特异性，可以用于检测疫苗半成品、成品等样品中Pichia pastoris细胞残留DNA；可为疫苗半成品、成品等生产环节提供等提供可靠的质控证据，为疫苗安全生产与使用提供重要保障。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种定量Pichia pastoris细胞残留的核酸检测试剂盒。

背景技术

实时荧光PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有核电偶联装置(CCD)的PCR扩增仪，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平。CCD能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，并通过软件分析汇总到工作站得到扩增曲线。TaqMan PCR技术是实时荧光PCR的一种。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出荧光的能量转移给淬灭基团，呈现淬灭效应。如果扩增过程中有靶序列的存在，扩增的过程中探针分子逐渐被水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光共振能量转移效应，荧光报告基团发出荧光信号。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。

与分子杂交方法相比，TaqMan PCR技术应用于定量检测中具有如下优点：通过对扩增曲线以及对数增长期的循环阈值(Ct)的分析，摒弃分子杂交法受多种因素干扰的终点分析方法，能够对待测样品进行准确定量分析，从而有效监测疫苗纯化的效果；将DNA扩增与检测过程融合为一体，可以实时、动态监测DNA扩增的全过程，省掉了分子杂交后处理过程，大大缩短了结果分析时间，使得该方法更加快捷、方便；由于采取一种封闭的检测模式，从而减少了气溶胶污染和由此造成的假阳性；由于在普通PCR基础上增加了一条可与模板互补配对的荧光探针，有效结合了PCR和探针杂交的双重特异性，进一步提高了检测目标靶多核苷酸的特异性。因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的分子杂交方法，在病原体的定量或定性检测中得到十分广泛的应用。

美国食品与药品管理局(FDA)已经批准了一些定量检测病原体的PCR诊断试剂盒，如用于HIV、结核分枝杆菌、沙眼衣原体等的实时荧光PCR检测的试剂盒。同样，中国目前也已批准了乙型肝炎、丙型肝炎、HIV和SARS等的实时荧光PCR检测试剂盒的生产和临床应用。虽然已经有用染料法实时荧光PCR检测CHO细胞DNA残留的报道，但在疫苗残留DNA的检测中，目前还没有针对Pichia pastoris细胞DNA残留的精确定量、特异性强的探针法实时荧光定量PCR检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种定量Pichia pastoris细胞残留的核酸检测试剂盒，本试剂盒可用于检测疫苗样品中Pichia pastoris细胞残留DNA，从而对疫苗生产过程中进行质量监测。

本试剂盒的基本原理是利用一对靶多核苷酸的特异性引物和一条靶多聚核苷酸的特异性探针，在含有耐热DNA聚合酶、高质量的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)以及Mg²⁺的PCR反应缓冲液中，通过荧光PCR扩增仪实现靶多核苷酸的循环扩增，从而达到快速、定量检测靶多核苷酸的目的。

本发明所提供的检测疫苗样品中Pichia pastoris细胞残留DNA的试剂盒包括：(1)分别装有PCR扩增反应液、阴性质控品、阳性质控品和定量标准品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。其中，所述PCR扩增反应液中用于靶多核苷酸扩增的正向引物Pichia pastoris-F和反向引物Pichia pastoris-R的序列分别是：

5’-TTATTCCCCGTTACCCGTAGAA-3’(SEQ ID NO：1)