[发明专利]一套用于水稻表观基因组甲基化/去甲基化的载体系统

说明书

本发明公开了一套用于水稻表观基因组甲基化/去甲基化的载体系统。本发明提供了一套用于水稻表观基因组去甲基化的载体系统。该系统通过随机去甲基化水稻基因组来快速产生DNA甲基化变异。该系统涉及水稻OsALKBH DNA 6mA去甲基化酶的表达，导致广泛的低甲基化。该“诱变”技术对于具有重要农业意义的植物，可能导致通常由DNA甲基化沉默的等位基因的差异表达，从而揭示先前隐藏的表型变异的应用具有重要意义。

技术领域

本发明涉及基因定向表达线路合成技术领域，具体涉及一套用于水稻表观基因组甲基化/去甲基化的载体系统。

背景技术

基因工程和合成生物技术已成为研究和改良作物性状的重要手段。随着基因编辑工具锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEs)以及CRISPR/Cas9系统的开发利用，靶定和修饰特异的基因组序列来研究相关基因功能的条件已经变得非常成熟。越来越多的研究将基因编辑工具用于表观遗传修饰以及基因调控。

水稻是世界上主要的粮食作物之一，也是功能基因组研究的模式植物。基于水稻基因组的研究已经相对成熟，然而，可能引起水稻表型强烈变化的表观修饰研究还处于起步阶段。

DNA甲基化对于基因调控、转座沉默及基因印记都十分重要。尽管特异DNA甲基化模式的产生对于这些进程非常重要，然而在每个位点上甲基化是如何被调控的还不清楚。已有研究发现，植物基因启动子DNA甲基化有时会导致转录抑制，甲基转移酶突变体DNA甲基化缺失导致基因表达改变和严重发育缺陷。然而，许多情况下自然发生的DNA甲基化变异已经被报道，由此改变表达的差异甲基化基因是负责农学上的重要性状。操纵植物甲基化来产生表观遗传学上不同的个体的能力对于育种和研究目的可能是无价的。

发明内容

本发明的目的是提供一套高效在水稻中实现基因组DNA甲基化/去甲基化的载体系统。

本发明首先保护一种表达载体，包括表达盒1和表达盒2；

所述表达盒1由水稻特异性Act1启动子启动功能片段甲表达；

所述表达盒2由水稻特异性Act1启动子启动功能片段乙表达；

所述功能片段甲包括10个拷贝GCN4肽的编码序列和dCas9的编码序列；

所述功能片段乙包括sfGFP的编码序列、特定酶的编码序列和单链可变片段scFv的GCN4抗体的编码序列；所述特定酶为水稻特异性甲基化酶或水稻特异性去甲基化酶。

所述功能片段甲还包括3×SV40 NLS序列。

所述功能片段乙还包括2×SV40 NLS序列。

所述特定酶具体可为水稻特异性DNA 6mA去甲基酶。

所述水稻特异性DNA 6mA去甲基酶具体可为OsALKBH1；

所述OsALKBH1是如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)将SEQ ID No.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有相同功能的由SEQ ID No.2生的蛋白质；

(a3)与SEQ ID No.2自所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

所述水稻特异性Act1启动子为如下(b1)或(b2)或(b3)：

(b1)SEQ ID No.1自5’端所第第2889-3731位所示的DNA分子；

(b2)在严格条件下与(b1)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；