[发明专利]白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠的构建方法与应用

说明书

本发明公开了白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45‑DTR转基因小鼠的构建方法与应用，通过酶切线性化BAC Clone CD45‑DTR，利用电穿孔法导入小鼠胚胎干细胞BALB/C ES细胞，得到插入IRES‑DTR至CD45外显子1位点的BALB/C ES细胞，随后将此BALB/C ES细胞通过囊胚注射法构建插入IRES‑DTR至CD45外显子1位点的CD45‑DTR转基因小鼠。本发明提供一种新型可诱导的、选择性清除免疫细胞的小鼠模型的构建方法，可以广泛应用于制备人源化小鼠，研究免疫细胞功能等领域。

技术领域

本发明涉及动物模型构建领域。更具体地，涉及一种白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠的构建方法。

技术背景

免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞。包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。免疫细胞可以分为多种，在人体中各种免疫细胞担任着重要的角色，其功能是不能被忽视的。为了研究免疫细胞的功能，一个重要的实验就是在体内清除免疫细胞，所以开发能够特异性清除免疫细胞的动物模型具有重要作用，白喉毒素受体-白喉毒素(DTR-DT)系统是近年来发展起来的一种用于诱导特定细胞群凋亡的系统。白喉毒素(DT)是白喉棒状杆菌产生的一种毒素，包含A和B两个亚基，而白喉毒素受体(DTR)又称人类肝素结合的表皮生长因子样生长因子(hbEGF)。当DT通过B亚基与DTR结合时，整个毒素将通过受体介导的内吞作用内化，毒素的亚单位A随后可抑制蛋白质的翻译，导致细胞凋亡而死亡。目前使用DT来诱导制备免疫细胞清除动物模型方面还存在着传代不稳定，免疫细胞清除效率低，选择性差，正常细胞容易受影响等不足。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的免疫细胞清除动物模型的不足，提供一种新型可诱导的、选择性清除免疫细胞的小鼠模型的构建方法，CD45是一种特异性表达于免疫细胞表面的信号分子，所以我们选择CD45作为驱动DTR表达的基因构建转基因小鼠，这样在免疫细胞中会表达DTR，而不表达的组织中不表达DTR，注射合适剂量的DT就可以选择性地诱导免疫细胞凋亡。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠的构建方法，包括以下步骤：

S1.酶切线性化BAC Clone CD45-DTR载体(由本公司构建，具体构建过程见实施例)，利用电穿孔法导入小鼠胚胎干细胞BALB/C ES细胞，得到插入IRES-DTR至CD45外显子1位点的BALB/C ES细胞；

S2.利用插入IRES-DTR至CD45外显子1位点的BALB/C ES细胞，囊胚注射法构建插入IRES-DTR至CD45外显子1位点的CD45-DTR转基因小鼠。

进一步的，上述一种白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠的构建方法，所述步骤S1具体包括以下步骤：

(1)小鼠胚胎成纤维细胞用MEF培养基培养，经30Grayγ射线灭活处理后作为滋养层细胞。BALB/C ES细胞(以下简述为ES细胞)种在滋养层细胞上，用ES培养基培养；

(2)电穿孔法将利用PI-SceI酶切线性化的打靶载体BAC Clone CD45-DTR转入ES细胞，使BAC Clone CD45-DTR整合至基因组中；

(3)利用G418阳选，挑选得到插入BAC Clone CD45-DTR的BALB/C ES细胞克隆；

(4)提取ES细胞基因组DNA为模板，进行PCR鉴定。

进一步的，上述一种白喉毒素调控清除免疫细胞的CD45-DTR转基因小鼠的构建方法，所述步骤S1中的步骤4具体为：