[发明专利]一种用于纯化游离DNA的微米级生物磁珠的制备方法

说明书

本发明公开了一种用于纯化游离DNA的微米级生物磁珠的制备方法。本发明方法工艺简单，制备的磁珠呈核壳壳结构，粒径均匀且单分散无团聚，磁响应性能强，表面粗糙，形貌丰富，比表面积大，表面羟基含量丰富，可用于纯化游离DNA样品。

技术领域

本发明属于纳米材料和生物技术工程的结合领域，具体涉及一种用于纯化游离DNA的微米级生物磁珠的制备方法。

背景技术

传统分离核酸法主要有盐析法、二氧化硅法，有机法等，费时费力且会用到有机溶剂。

生物磁珠是涉及纳米材料科学和生物科学的一种新型功能化材料。其表面易于改性修饰，通过外加磁场便可快速实现固液分离，操作简便。生物磁珠在微量核酸提取、细胞筛选等方面有着良好的应用前景。快速高效地分离得到高纯度核酸是现代分子生物学领域进行各种科学研究的重要先决条件。

但目前存在以下问题：进口磁珠价格高昂，绝大部分国产磁珠粒径为亚微米级，粒径不够均一，比表面积小，静置悬浮性差，黏壁，重分散性差。导致与血浆中的小片段游离DNA结合能力弱，再提取过程中容易丢失，导致得率低，使检测灵敏度降低。

发明内容

为解决上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于纯化游离DNA的微米级生物磁珠的制备方法。本发明方法工艺简单，制备的磁珠呈核壳壳结构，粒径均匀且单分散无团聚，磁响应性能强，表面粗糙，形貌丰富，比表面积大，表面羟基含量丰富，可用于纯化游离DNA样品。

本发明采取的具体技术方案是：

一种用于纯化游离DNA的微米级生物磁珠的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：采用分散聚合法合成模板微球；

步骤二：对模板微球表面进行浓硫酸处理，得到表面含磺酸基团的模板微球；

步骤三：在水相中原位沉积法在模板微球表面包裹一层四氧化三铁；

步骤四：通过溶胶凝胶法在四氧化三铁表面包覆一层二氧化硅，得到微米级生物磁珠。

作为对上述方案的进一步优化，上述的制备方法，具体包括以下步骤：

步骤一：将有机溶剂、超纯水、分散剂依次倒入容器中，搅拌至溶液澄清，然后再向容器中依次加入聚合单体、交联剂、引发剂，搅拌数分钟至混合液澄清后，水浴升温进行聚合反应，反应结束后冷却至室温，用有机溶剂和水依次离心洗涤，得模板微球，将模板微球分散至超纯水中，得模板微球悬浮液；

步骤二：取模板微球悬浮液，离心弃上清液，缓慢滴加入浓硫酸，同时冰浴处理，防止放出大量热量，导致暴沸和粒径模板微球结块，待浓硫酸完全加入后，机械搅拌反应1-2h，加入与浓硫酸等体积的冰水稀释浓硫酸，超纯水反复离心洗涤至溶液呈中性，得到表面带磺酸基团的模板微球；

步骤三：将表面带磺酸基团的模板微球分散于超纯水中，配制成悬浮液，然后向悬浮液中依次加入分散剂、三价铁化合物和亚铁化合物，配制成铁盐溶液，升温搅拌进行耦合反应老化10-30min，缓慢加入沉淀剂至溶液完全变黑，继续反应熟化0.5-2h后，冷却至室温，超纯水洗涤，得表面包覆有一层四氧化三铁的磁性微球；

步骤四：将步骤三得到的表面包覆有一层四氧化三铁的磁性微球均匀分散在乙醇/水体系内，加入氨水，搅拌数分钟后加入正硅酸四乙酯，室温反应不少于12h，反应结束后用醇和水溶液依次交替洗涤，分散于水溶液后，得到表面包覆一层二氧化硅的微米级生物磁珠。

作为对上述方案的进一步优化，步骤一中所述有机溶剂为水溶性一元醇溶剂；和/或

步骤一中所述分散剂为聚乙烯吡咯烷酮；和/或

步骤一中所述聚合单体为苯乙烯或者甲基丙烯酸甲酯；和/或