[发明专利]一种针对甘蔗的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种针对甘蔗的CRISPR/Cas9载体，由序列如SEQ ID NO.2所示pUC57‑simple‑sgRNA载体HindIII酶切后的片段与CPB‑ZmUbi‑hspCas9载体HindIII酶切后的片段连接而成。本发明首次构建了针对甘蔗的CRISPR/Cas9载体，能够快速简单地对甘蔗基因进行高效的定点突变，实现特定位点的定向基因编缉，从而造成目的基因序列永久的缺失，为甘蔗基因功能的研究及利用分子育种技术来培育新品种提供技术支撑，而且本申请直接采用化学合成的方法构建sgRNA的DNA序列，能够快速、方便完成的CRISPR‑Cas9系统构建，促进甘蔗基因编辑系统的开发与应用。

技术领域

本发明属于基因工程，具体其涉及一种针对甘蔗的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用。

背景技术

基因组编辑技术CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats/CRISPR associated 9)系统，主要包含单向导RNA(sgRNA)和Cas9蛋白。Cas9和sgRNA形成一个复合物，成功表达的sgRNA通过自身的Cas9把手(Cas9 handle)与Cas9蛋白形成复合体；然后，复合体开始搜寻并匹配PAM(主要为NGG)序列,随后sgRNA的碱基互补配对区序列通过碱基互补配对原则识别目标记的靶标序列，Cas9蛋白利用自身的核酸内切酶活性对靶序列进行切割,形成DNA双链断裂(double-strand break,DSB)，产生可位点特异性DNA改变。2013年,CRISPR/Cas9系统在哺乳动物细胞建立后,便迅速在拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana benthamiana)等模式植物的原生质体、外植体和叶片组织中应用，之后CRISPR/Cas9系统便迅速在二倍体植物水稻、玉米(Zea mays)、大麦(Hordeum vulgare)、马铃薯(Solanumtuberosum)、以及多倍体植物棉花(Gossypiumhirsutum)、小麦(Triticum aestivum)油菜(Brassica napus)等中实现了可遗传的基因编辑,并在研究过程中对CRISPR/Cas9系统的靶基因的特异性、突变效率等方面进行了优化和应用。

甘蔗是我国第一大热带作物，我国食糖的总产量80％来源与甘蔗，甘蔗为异源多倍体植株(水稻、玉米为二倍体)，基因拷贝数多，基因冗余严重，甘蔗基因组编辑平台由于其多倍性和遗传转化效率低而落后于其它作物植物。为了更好进行功能基因组学和分子育种研究，建立准确的定点突变甘蔗株系显得非常必要，目前尚无关于甘蔗的定点突变的系统，因此建立高效的针对甘蔗的CRISPR/Cas9系统并将其应用于甘蔗的基因编辑系统显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种针对甘蔗的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用。

本发明的第一个方面是提供一种针对甘蔗的CRISPR/Cas9载体，其含有Cas9表达序列以及sgRNA的DNA序列，由pUC57-simple-sgRNA载体HindIII酶切后的片段与CPB-ZmUbi-hspCas9载体HindIII酶切后的片段连接而成，其中，所述sgRNA的DNA序列如SEQ IDNO:1所示，所述pUC57-simple-sgRNA载体的序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二个方面是提供一种如本发明第一个方面所述的CRISPR/Cas9载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)设计特异sgRNA的DNA序列，如SEQ ID NO.1所示，通过固相亚磷酸胺三酯法合成SEQ ID NO.1所示片段；

(2)将步骤(1)通过化学合成的方法一步获得的sgRNA的DNA片段克隆到pUC57-simple，获得pUC57-simple-sgRNA载体，序列如SEQ ID NO.2所示；