[发明专利]犬原代脂肪间充质干细胞的无血清分离提取方法

说明书

本发明公开了犬原代脂肪间充质干细胞的无血清分离提取方法，包括以下步骤：S1：实验前培养箱、实验用具灭菌，试剂提前配置好，在基础培养基中添加脂肪MSC添加因子和1％PS，即双抗，制备成完全培养基，室温放置；S2：通过外科手术在犬腹部或腹股沟处取皮下脂肪10ml；S3：20mlPBS，即磷酸缓冲盐溶液，加1％PS置于冰盒中带回实验室放入超净台中；S4：PBS冲洗3次直到液体无血色后剔除筋膜和血管将脂肪放在培养皿中剪成糊状；S5：将剪好的脂肪放入50ml离心管内，PBS反复清洗，在1000r/min离心5min去上清；本发明的目的在于提供犬原代脂肪间充质干细胞的无血清分离提取方法，提供了一种安全、简单方便、高质量、高纯度的犬脂肪间充质干细胞的提取培养体系。

技术领域

本发明涉及脂肪间充质干细胞分离提取技术领域，更具体地说，涉及犬原代脂肪间充质干细胞的无血清分离提取方法。

背景技术

脂肪干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSC)被认为是一类来源于脂肪组织的间充质干细胞。脂肪组织在动物体内储存充分，获取脂肪组织的操作简单，损伤较小。同时ADMSC性状稳定，各种临床研究和应用中证明ADMSC具有分化为肌肉、骨、表皮、内皮及血细胞等多种细胞的潜能，还可以通过旁分泌作用降低目标组织的炎性反应，加速损伤的复原。ADMSC已经成为组织工程和再生医学的研究热门之一。犬是最常见的伴侣动物以及新型实验动物之一。随着生活水平的提升，犬的老年疾病在临床上变得更加常见，尤其是多种慢性疾病，比如骨关节炎(osteoarthritis，OA)、髋关节发育不良(canine hipdysplasia，CHD)等。这些疾病目前没有特别有效的治疗方法，不仅影响了患病动物的生活质量，还需要主人投入大量时间和金钱。目前已经有学者开始进行干细胞治疗各种犬类疾病的研究。研究发现，ADMSC可有效改善、治疗多种炎症疾病及多种病症。ADMSC作为一种具有优势的干细胞，在犬的各种慢性疾病的治疗中具有极大的临床应用潜能。因此，更好的分离出稳定、纯度高的犬脂肪间充质干细胞可以为临床转化应用及进一步进行犬疾病模型的干细胞治疗评价奠定基础。

目前，间充质干细胞体外扩增培养体系中一般都含有一定浓度的胎牛血清。然而，间充质干细胞在高浓度血清培养时，随着传代次数增加，细胞增殖能力下降，形态由长梭形变为宽大扁平，逐渐老化，丧失多向分化能力。另外，动物血清可能存在动物携带的潜在病毒或支原体污染，对以后可能的临床应用构成威胁。

为此，提出犬原代脂肪间充质干细胞的无血清分离提取方法。

本发明内容

1.要解决的技术问题

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供犬原代脂肪间充质干细胞的无血清分离提取方法，提供了一种安全、简单方便、高质量、高纯度的犬脂肪间充质干细胞的提取培养体系，本发明选用了脂肪间充质干细胞无血清培养基和脂肪温和消化酶，培养液中添加了适宜间充质干细胞生长的添加因子，使提取出的细胞纯度更高。同时避免了使用胎牛血清中动物源成分带来的病毒及支原体污染问题，提高了原代细胞消化率，解决了使用胎牛血清容易使细胞老化的问题。可使细胞安全、直接的应用于宠物临床。

2.技术方案

为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。

犬原代脂肪间充质干细胞的无血清分离提取方法，包括以下步骤：

S1：实验前培养箱、实验用具灭菌，试剂提前配置好，在基础培养基中添加脂肪MSC添加因子和1％PS，即双抗，制备成完全培养基，室温放置；

S2：通过外科手术在犬腹部或腹股沟处取皮下脂肪10ml；

S3：20mlPBS，即磷酸缓冲盐溶液，加1％PS置于冰盒中带回实验室放入超净台中；

S4：PBS冲洗3次直到液体无血色后剔除筋膜和血管将脂肪放在培养皿中剪成糊状；