[发明专利]一种检测柑橘半穿刺线虫的引物和探针组合及其应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种检测柑橘半穿刺线虫的引物和探针组合及其应用。该引物和探针组合包括正向引物Ts‑RPA‑F、反向引物Ts‑RPA‑R、探针Ts‑RPA‑P；正向引物Ts‑RPA‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；反向引物Ts‑RPA‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；探针Ts‑RPA‑P的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。本发明引物和探针组合及其检测方法具有特异性强、灵敏度高、设备简单、检测快速等优点。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种检测柑橘半穿刺线虫的引物和探针组合及其应用。

背景技术

柑橘半穿刺线虫(Tylenchulus semipenetrans)是一种广泛分布于全世界柑橘产区的定居型半内寄生线虫，能引起柑橘慢衰病(Citrusslowdecline disease)，可造成重大的经济损失。柑橘被侵染后活力减退，叶片褪绿黄化，长势衰弱似缺肥、缺水、生长不良症状，严重时叶片脱落，果实变小，甚至枯死。柑橘受害后一般减产30％～50％，严重时达100％。

由于柑橘半穿刺线虫在柑橘根部侵染危害，虫体细小，无法用肉眼观察到，虽发生普遍，危害严重，但其引起的柑橘慢衰病在柑橘生产中却得不到重视，基层技术人员和种植户基本不认识或不了解该病害，所表现的黄化症状常被误诊为柑橘黄龙病，而进行抛荒、砍伐或挖除，造成重大经济损失。快速、准确地鉴定和检测柑橘半穿刺线虫，对柑橘慢衰病的田间检测和监测及有效防控至关重要。

柑橘半穿刺线虫的鉴定和检测方法主要包括传统的形态学鉴定和以PCR为基础的分子检测。由于形态学鉴定不仅耗时、费力，而且需要专业的技能和丰富的线虫形态学鉴定经验，难以达到快速诊断和检测的目的。虽然PCR检测方法在一定程度上克服了形态学鉴定上的缺陷，但需要昂贵的仪器设备，检测过程复杂、时间较长，不利于现场快速检测及基层普及应用。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)技术是一种新型体外恒温核酸扩增技术，该技术依赖于一对30～35bp长度的引物和三种酶(重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶)，在37～42℃恒温条件下反应5～20min，就可快速完成核酸的大量扩增。RPA扩增产物结合侧流层析试纸条技术(Lateral flow dipstick，LFD)，可在30min内完成对柑橘半穿刺线虫的可视化检测。由于RPA技术不需要专业的仪器设备，在普通的水浴锅或简单的恒温器中即可完成，具有操作简单、快速、特异性强、灵敏度高、检测方便等优点，可以真正实现便携式的快速核酸检测。目前，尚未见其在柑橘半穿刺线虫检测方面的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种检测柑橘半穿刺线虫的引物和探针组合及其应用。该引物和探针组合及其检测方法具有特异性强、灵敏度高、设备简单、检测快速等优点。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种检测柑橘半穿刺线虫的引物和探针组合，包括正向引物Ts-RPA-F、反向引物Ts-RPA-R、探针Ts-RPA-P；

正向引物Ts-RPA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

反向引物Ts-RPA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

探针Ts-RPA-P的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。

作为优选，反向引物Ts-RPA-R核苷酸序列的5’端标记有生物素；探针Ts-RPA-P核苷酸序列的5’端标记有荧光素，距离5’端至少31bp处的碱基进行脱碱基位点修饰，3’端修饰有阻断聚合酶扩增的基团。