[发明专利]一种通过敲除丙酮酸转运蛋白基因提高工程菌发酵生产丙酮酸的方法

说明书

本发明公开了一种通过敲除丙酮酸转运蛋白基因提高工程菌发酵生产丙酮酸的方法，是以重组产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytocaPDL‑7ΔpflBΔldhD::nox为出发菌株，敲除其丙酮酸转运蛋白基因cstA和yjiY，构建能提高丙酮酸发酵生产能力的产酸克雷伯氏菌工程菌株，命名为Klebsiella oxytocaPDL‑CY；实验证实以葡萄糖为底物，所构建工程菌株发酵生产丙酮酸的产量为103.31g/L，底物转化率达到0.90g/g；相比于出发菌株，所构建工程菌株的丙酮酸产量和底物转化率分别提高了67.8％和76.8％。本发明的方法过程简便，产物成分单一易分离，具有重要的经济效益和社会意义。

技术领域

本发明涉及一种提高微生物发酵生产丙酮酸的方法，尤其涉及一种通过敲除丙酮酸转运蛋白提高产酸克雷伯氏菌工程菌株发酵生产丙酮酸的方法，属于羧酸的生物发酵制备技术领域。

背景技术

丙酮酸是生物体内生化代谢网络中的重要中间体^[1]。同时丙酮酸作为一种基本化工原料，广泛应用于化学、医药、食品、农业及环保等各个领域中^[2,3]。另外，丙酮酸也是一些高附加值产物如丙氨酸、异丁醇和类胡萝卜素等的前体，具有广泛的应用前景^[3]。

目前商业用丙酮酸主要来源是基于不可再生资源的化学合成方式，主要通过酒石酸脱水和脱羧生成丙酮酸^[4]。该工艺反应剧烈难控制、污染严重，且化学合成的丙酮酸在食品、医药、日化等领域的应用受到限制。因此有广泛研究者致力于通过微生物发酵技术实现丙酮酸的生产。目前，已有报道多种微生物均可以用来生产丙酮酸，例如大肠杆菌，光滑球拟酵母，酿酒酵母等通过代谢工程技术以葡萄糖为底物实现了丙酮酸的高效生产^[5-7]。然而这些工程菌株较低的底物转化率限制了丙酮酸的产量，并造成了一定的碳损失。丙酮酸是微生物代谢网络中的关键中间体，在大肠杆菌发酵生产丙酮酸的后期，丙酮酸会迅速与葡萄糖共代谢^[8]。申请人研究发现通过敲除丙酮酸转运蛋白基因，抑制丙酮酸的再利用有望提高丙酮酸的生产效率。经检索，通过敲除丙酮酸转运蛋白基因实现提高微生物发酵生产丙酮酸的方法尚未有报道。

参考文献：

[1]S.V.Kamzolova and I.G.Morgunov.(2016)Biosynthesis of pyruvic acidfrom glucose by Blastobotrys adeninivorans.Appl.Microbiol.Biotechnol.100:7689-7697.

[2]S.Li,X.Chen,L.Liu and J.Chen.(2016)Pyruvate production in Candidaglabrata:manipulation and optimization of physiologicalfunction.Crit.Rev.Biotechnol.36:1-10.

[3]M.Yang and X.Zhang.(2017)Construction of pyruvate producing strainwith intact pyruvate dehydrogenase and genome-wide transcription analysis.World.J.Microbiol.Biotechnol.33:59.

[4]Y.Li,J.Chen and Y.Lun.(2001)Biotechnological production of pyruvicacid Appl.Microbiol.Biotechnol.57:451-459.