[发明专利]一种灰尘中尘螨过敏原蛋白Der f1和Der p1及其硝化产物的检测方法

说明书

本发明公开了一种灰尘中尘螨过敏原蛋白Der f1和Der p1及其硝化产物的检测方法。本发明建立了一种能够同时测定灰尘中两种主要尘螨过敏原蛋白Der f1和Der p1及其硝化产物Nitrated Der f1和Nitrated Der p1的检测方法。灰尘样品中的尘螨过敏原蛋白及其硝化产物经酶解消化成小分子的多肽，选择其中的一条丰度最高的多肽作为尘螨过敏原蛋白及其硝化产物的特征多肽，超高效液相色谱‑串联质谱(UPLC‑MS/MS)对这些特征多肽进行定性定量，通过换算从而对尘螨过敏原蛋白及其硝化产物进行定性和定量分析。本方法选择性好，准确度和分析通量高，本方法克服了传统ELISA(酶联免疫吸附法)方法检测通量低，可能存在结构类似物的交叉反应和无法准确定量硝化蛋白的缺点。

技术领域

本发明属于环境健康的过敏原蛋白检测领域，是一种利用超高效液相色谱-质谱联用技术(UPLC/ESI-MS/MS)，选择尘螨主要过敏原蛋白Der f1和Der p1及其硝化产物Nitrated Der f1和Nitrated Der p1为研究对象，建立的能够同时测定灰尘中两种尘螨主要过敏原蛋白含量及其硝化产物(共四种过敏原蛋白)的定量检测方法。

背景技术

随着工业化程度的提高，哮喘、过敏性鼻炎、湿疹等过敏性疾病在全世界范围内呈逐年增高的趋势，世界卫生组织(WHO)已经把过敏性疾病列为“21世纪重点研究和预防的疾病”。目前全球已有大量研究证实了尘螨与过敏性哮喘、过敏性鼻炎、湿疹等过敏性疾病密切相关。尘螨在全世界各个国家都有分布，全世界范围内最为常见的尘螨种类是屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)和粉尘螨(Dermatophagoides farinae)。尘螨中的某些蛋白质被认为是导致过敏的主要成分。免疫学研究证明，I类过敏原蛋白是引发尘螨过敏性疾病的主要因素，超过80％的尘螨过敏患者对I类过敏原蛋白(粉尘螨I类过敏原蛋白Derf1和屋尘螨I类过敏原蛋白Der p1)的皮肤针刺试验和血清IgE检测呈阳性。

有研究表明，O₃浓度水平的升高和NO_X的存在会引起过敏原蛋白的硝化，从而提高过敏原蛋白的致敏性，使得人体罹患过敏性疾病的风险增加。蛋白质的硝化主要是指蛋白质中酪氨酸残基被硝化成3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine，3-NT)的过程。空气污染是当前我国面临的主要环境问题之一。尽管经过近几年的强力治理，PM₁₀、PM_2.5、SO₂等典型大气污染物已经得到初步的控制，但O₃的浓度却在逐年升高，这使得过敏原蛋白被硝化的可能性大大增强，给人们的健康增添极大的隐患。因此，环境中过敏原蛋白和硝化过敏原蛋白的存在及含量状况亟需得到大家的重视。

1988年世界卫生组织(WHO)召开的尘螨与哮喘国际研讨会上制定了暂行的评价标准：Der p1含量超过2μg·g^-1足以引起过敏症状，是致敏和哮喘发生的危险因素，Der p1含量超过10μg·g^-1则足以诱发对尘螨过敏的哮喘病人急性发作或更重的临床病症。未硝化的过敏原蛋白在环境中超过一定含量就可以对人体健康构成威胁，使得罹患尘螨过敏性疾病的机率大大增加，而已有的研究表明，硝化后的过敏原蛋白其致敏性会增强，使得人体健康的风险更大，因此，对人居环境中尘螨过敏原蛋白及其硝化产物准确定性定量显得尤为重要。通过研究环境灰尘样本中尘螨过敏原蛋白及其硝化产物的含量水平，揭示环境中尘螨过敏性疾病的健康风险，从而对有效地预防和避免尘螨过敏提出有效建议。

目前最常使用的检测过敏原的分析方法是基于抗体的酶联免疫吸附测定(ELISA)方法，ELISA方法灵敏度高，检测时间短，但目前市面上大部分试剂盒都是针对单一过敏原设计的，无法对多种过敏原同时进行检测，检测通量较低，并可能存在结构类似物的交叉反应，此方法难以适用于当今环境中多种过敏原的高通量及痕量检测。ELISA也可以用于硝化蛋白质的测定，但ELISA方法以硝化牛血清蛋白为对象制作标准曲线，而所检测的样品中硝化蛋白与抗体的结合能力可能与硝化牛血清蛋白不同，因此ELISA方法只是半定量检测硝化蛋白的方法，而且抗体也并非目标硝化蛋白质的特应性抗体。