[发明专利]CRISPR/RfxCas13d抗植物RNA病毒载体及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种CRISPR/RfxCas13d抗植物RNA病毒载体及其构建方法和应用，包括pCambia1300‑RfxCas13d重组载体，构成如下：CaMV 35S启动子，潮霉素基因，CaMV poly(A)信号终止子，pVS1 RepA，pVS1复制起点，CaMV 35S启动子，RfxCas13d基因，NOS终止子；其中，RfxCas13d基因序列如SEQ ID No.1所示，NOS终止子序列如SEQ ID No.2所示。本发明利用带有GFP荧光标签的芜菁花叶病毒(TuMV‑GFP)侵染性克隆来指示RNA病毒自然侵害植物，利用RfxCas13d蛋白和sgRNA结合可以定向特定位置切割RNA。本发明构建的载体能够有效抑制TuMV的侵染，为植物病毒病的防控提供新的策略，具有重要的生产意义。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种高效定点编辑的CRISPR/RfxCas13d抗植物病毒载体及其构建方法和应用。

背景技术

基因组定点编辑技术是一种有效高质技术手段，可以用于植物功能基因组研究和作物分子遗传育种。基因组编辑技术主要通过以下三种人工内切核酸酶分别为：锌指核酸酶ZFNs、类转录激活因子效应物核酸酶TALENs和基于CRISPR/Cas系统的由RNA引导的内切酶。针对DNA的基因编辑过程是在基因组靶位点处产生双链DNA断裂(DSBs)，DSBs可以通过非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HDR)进行修复。在CRISPR-Cas系统的RNA引导内切核酸酶系统中的内切核酸酶，如SpCas9和LbCpf1，已被证明是用于植物基因编辑和调控的多功能工具酶。RNA基因编辑是近些年在发现新型Cas蛋白(主要是Cas13蛋白)发展起来的。RNA一旦被切割之后，直接被降解。

在自然界中，植物病毒侵染植物的现象相当普遍。植物病毒可以感染许多重要的农作物，是影响农业生产的重要因素之一。植物病毒在世界各地广泛分布，除一小部分是DNA病毒外，大部分的植物病毒基因组是单链RNA(ssRNA)病毒。其中，芜菁花叶病毒(Turnipmosaic virus,TuMV)是单链、正义的植物RNA病毒，属于马铃薯Y病毒科病毒。TuMV能够侵染十子花科多种蔬菜作物与油料作物，是我国及世界农业生产上重要的病原物。目前，无有效的手段防治TuMV的侵染。

发明内容

本发明的目的是提供一种CRISPR/RfxCas13d抗植物RNA病毒载体及其构建方法和应用。

本发明利用基因编辑技术直接靶向TuMV的RNA序列，导致目标RNA的切割和降解，实现抗病毒应用。本发明使用了来自Ruminococcus flavefaciens菌株strain XPD3002的细菌蛋白RfxCas13d蛋白，开发了基于RfxCas13d系统的CRISPR植物基因组编辑工具。这种工具可以更高效切割RNA、更广泛地识别特异基因组序列，是一种高效地抗植物RNA病毒的工具。

一种CRISPR/RfxCas13d抗植物RNA病毒载体，包括pCambia1300-RfxCas13d重组载体，构成如下：CaMV 35S启动子，潮霉素基因，CaMV poly(A)信号终止子，pVS1 RepA，pVS1复制起点，CaMV 35S启动子，RfxCas13d基因，NOS终止子；

其中，RfxCas13d基因序列如SEQ ID No.1所示，NOS终止子序列如SEQ ID No.2所示；RfxCas13d编码的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。