[发明专利]携带人ROCK2基因的慢病毒载体及其构建和应用

说明书

本发明公开了一种携带人ROCK2基因的慢病毒载体及其构建和应用，属于生物医学技术领域。所述携带人ROCK2基因的慢病毒载体是将人ROCK2基因插入载体GV287‑Ubi‑MCS‑3FLAG‑SV40‑EGFP的AgeI酶切位点所得；所述人ROCK2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过构建携带ROCK2基因的慢病毒，可大大提高真核细胞转染效率，并且ROCK2基因可整合内皮细胞基因组，进行长时间稳定表达，筛选得到稳定表达ROCK2基因的细胞株。

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及携带人ROCK2基因的慢病毒载体及其构建和应用。

背景技术

Rho相关的卷曲螺旋型蛋白激酶(Rho-associated,coiled-coil containingprotein kinase，ROCK)是小GTP结合蛋白Rho的效应器。ROCK最初于1996年是第一个被发现Rho下游效应器，Rho相关的卷曲螺旋激酶(ROCK)家族包括ROCK1和ROCK2，ROCK蛋白共有约65％的总氨基酸序列具有同一性，而它们的激酶结构域约92％相似。有研究发现，ROCK1的mRNA和蛋白在肺、肝、脾、肾和睾丸中高度表达，而ROCK2在脑和心脏中表达丰富。ROCK2主要定位于细胞质，与波形蛋白和肌动蛋白应力纤维相关，相比之下，ROCK1的细胞内分布研究还不是很明确。ROCK对各种细胞功能起着重要作用，包括平滑肌收缩﹑肌动蛋白细胞骨架组织﹑细胞粘附和迁移﹑细胞分裂和基因表达。

研究显示，ROCK的激活参与了很多心血管疾病，如高血压和动脉粥样硬化。临床上使用的唯一的ROCK抑制剂法舒地尔对控制血压、调节动脉硬化性冠状动脉病变以及治疗心衰等方面表现出了令人满意的效果，但是法舒地尔是非选择性抑制剂，对两种亚型ROCK均有抑制作用，筛选出特异性强或者选择性高的ROCK抑制剂很重要。但是由于缺乏有效的体外筛选模型，因此得到选择性ROCK抑制剂较为困难。

传统基因过表达真核细胞株构建所采用的是重组质粒转染、G418筛选，容易出现以下问题：脂质体转染效率低，电转费用又昂贵；筛选周期长至少三个月，消耗过多的人力，财力；筛出的假阳性比例高，很容易出现假阳性也能在G418筛选压力下生长的情况；筛选出的细胞株往往不能长时间稳定表达基因。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种携带人ROCK2基因的慢病毒载体，可以用于筛选出能够稳定表达ROCK2的血管内皮细胞模型，该模型将可用于筛选能够选择性抑制ROCK2的化合物。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种携带人ROCK2基因的慢病毒载体，是将人ROCK2基因插入载体GV287-Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP的AgeI酶切位点所得；

所述人ROCK2基因的核苷酸序列如下(SEQ ID NO.1)：