[发明专利]一种磷酸化多肽和截短蛋白的共价偶联方法及其应用

权利要求书

1.一种磷酸化多肽和截短蛋白的共价偶联方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将Tau截短蛋白和Tau磷酸化多肽溶解到磷酸盐缓冲液中并混匀，所述Tau截短蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述Tau磷酸化多肽为181磷酸化多肽、231磷酸化多肽或396磷酸化多肽；

S2、在上述混合液中，加入戊二醛进行偶联反应；

S3、偶联反应结束后，将上述反应液放入磷酸盐缓冲液中透析，再换用Tris-Hcl缓冲液透析，然后获得蛋白-磷酸化多肽偶联物，即形成重组磷酸化蛋白；

S4、对上述偶联物进行浓度测定，最终用Tris-Hcl缓冲液进行保存；

其中，所述Tau磷酸化多肽为181磷酸化多肽，多肽序列如下所示：AKTPPAPKT（p）PPSSGEPPK，其序列如SEQ ID NO:2所示，其中苏氨酸T位点添加有磷酸基团；最终获得的蛋白-磷酸化多肽偶联物为重组pTau-181磷酸化蛋白，用于作为pTau-181磷酸化蛋白检测标品；所述Tau磷酸化多肽为231磷酸化多肽，多肽序列如下所示：PKKVAVVRT(p)PPKSPSSAK，其序列如SEQ ID NO:3所示，其中苏氨酸T位点添加有磷酸基团；最终获得的蛋白-磷酸化多肽偶联物为重组pTau-231磷酸化蛋白，用于作为pTau-231磷酸化蛋白检测标品；所述Tau磷酸化多肽为396磷酸化多肽，多肽序列如下所示：HGAEIVYKS(p)PVVSGDTSP，其序列如SEQ IDNO:4所示，其中丝氨酸S位点添加有磷酸基团；最终获得的蛋白-磷酸化多肽偶联物为重组pTau-396磷酸化蛋白，用于作为pTau-396磷酸化蛋白检测标品。

2.根据权利要求1所述的磷酸化多肽和截短蛋白的共价偶联方法，其特征在于，所述步骤S1中Tau截短蛋白和任一Tau磷酸化多肽的摩尔比为1︰5~10，所述步骤S2中选用20μl2.5%戊二醛，所述步骤S1和步骤S3中选用0.01M pH=7.2的磷酸盐缓冲液，所述步骤S3中选用0.05M pH=8.0 Tris-Hcl缓冲液，所述步骤S4中选用含1%BSA Tris-Hcl缓冲液。

3.根据权利要求2所述的磷酸化多肽和截短蛋白的共价偶联方法，其特征在于，在将Tau截短蛋白和任一Tau磷酸化多肽溶解到磷酸盐缓冲液中并混匀之前还包括制备Tau截短蛋白，具体包括以下步骤：将Tau截短蛋白的核苷酸序列连接至表达载体，并转入表达菌株中；在培养基中过夜诱导Tau截短重组蛋白可溶性表达并纯化，纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳。

4.一种采用权利要求1-3任一所述的磷酸化多肽和截短蛋白的共价偶联方法制备的重组pTau-181磷酸化蛋白、重组pTau-231磷酸化蛋白或重组pTau-396磷酸化蛋白在构建制备检测体系中的应用，其特征在于，所述检测体系构建包括以下步骤：

Q1、首先在固相载体上包被捕获抗体，浓度为5μg/mL；

Q2、将重组pTau-181磷酸化蛋白、重组pTau-231磷酸化蛋白或重组pTau-396磷酸化蛋白用10％BSA溶液稀释，再加入碱性磷酸酶标记的抗体，浓度50ng/ml，每孔100μL，37℃孵育30min；

Q3、用PBST清洗，化学发光底物加入后，检测发光值；

Q4、绘制校准曲线。

5.一种含有权利要求1-3任一所述的磷酸化多肽和截短蛋白的共价偶联方法制备的重组pTau-181磷酸化蛋白、重组pTau-231磷酸化蛋白或重组pTau-396磷酸化蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含有固相载体、碱性磷酸酶标记的检测抗体、发光底物。