[发明专利]基因IL-32在监测日本血吸虫病肝纤维化发展过程中的应用及药物应用

权利要求书

1.一种基因IL-32在监测日本血吸虫病肝纤维化发展过程中的应用。

2.根据权利要求1所述的一种基因IL-32在监测日本血吸虫病肝纤维化发展过程中的应用，其特征在于，具体包括以下过程：

(1)、实验动物及其分组

(1-1)选取36只6-8周龄的雌性ICR小鼠；将ICR小鼠随机分成A、B、C三组，每组12只；

(1-2)其中，A组为模拟感染组，即无血吸虫感染的对照组；B组为感染对照组，用日本血吸虫尾蚴经皮肤感染，每周腹腔注射200ul/只PBS缓冲液2次；C组为感染实验组，用日本血吸虫尾蚴经皮肤感染，每周注射含100ng人重组IL-32的200ul/只PBS缓冲液2次；分别于感染后6周、12周取样进行相关检测；

(2)、实验小鼠取样

(2-1)在设计的时间点，每组随机选取6只小鼠进行取样；

(2-2)待取样小鼠腹腔注射10％水合氯醛麻醉，然后将其固定在解剖台上；

(2-3)75％酒精消毒腹部后打开腹腔，充分暴露肝脏；

(2-4)在肝门静脉出插入输液针，灌注生理盐水，同时在下腔静脉处剪一小口作为流出通道。待肝脏颜色由鲜红变为土黄色，且下腔静脉流出液变得较澄清后，将肝脏游离取下置于无菌平皿中；

(2-5)肝脏分成3部分，一部分肝组织用10％甲醛固定后做石蜡切片，一部分肝组织用于提取RNA，一部分肝组织用于提取蛋白；

(3)、天狼星红染色检测肝脏胶原：使用天狼星红染色盒试剂盒进行染色(3-1)10％甲醛固定肝组织，常规脱水后进行石蜡包埋，切片厚度6μm，常规脱蜡至水；

(3-2)weigert铁苏木素染色液染色10-20分钟；

(3-3)酸性分化液分化5-10秒；

(3-4)自来水洗5-10分钟，蒸馏水漂洗一次；

(3-5)天狼星红染色液滴染1小时，流水冲洗，去除切片表面染料；

(3-6)常规脱水透明，中性树胶封固；

(3-7)光学显微镜下观察拍照；

(4)、实时定量荧光PCR检测肝脏α-SMA和Collagen-α1(I)的表达

(4-1)取新鲜小鼠肝组织50-150mg，剪成小块，放入1.5ml Eppendorf管中，立即加入1ml TRIzol，在冰上用塑料棒对组织进行研磨；

(4-2)按照TRIzol的说明书进行操作，最终提取肝组织总RNA用200ul nuclease-free水溶解；

(4-3)用NanoDrop2000测定RNA的浓度；

(4-4)取5ug总RNA，使用M-MLV逆转录酶进行逆转录反应，逆转录引物使用Oligo(dT)18；

(4-5)逆转录产物即为各个样品的cDNA；

(4-6)以得到的cDNA为模板，使用Eco实时定量PCR仪进行RT-qPCR；

引物如下，GAPDH，F：5’-AAGGGCTCATGACCACAGTC-3’；

GAPDH，R：5’-ACACATTGGGGGTAGGAACA-3’；

α-SMA，F：5’-GTCCCAGACATCAGGGAGTAA-3’；

α-SMA，R：5’-TCGGATACTTCAGCGTCAGGA-3’；

Collagen-α1(I)，F：5’-CCTGGCAAAGACGGACTCAAC-3’；

Collagen-α1(I)，R：5’-GCTGAAGTCATAACCGCCACTG-3’；

(4-7)20μl反应体系如下：SYBR Premix Ex Taq 10μl，Forward primer 0.4μl，Reverse primer 0.4μl，cDNA模板2μl，ddH₂O 7.2μl；

RT-qPCR反应程序：95℃，5min；95℃ 5s、60℃ 30s、72℃ 30s，40个循环；95℃ 15s、60℃ 30s、95℃ 15s，溶解曲线分析；

数据使用ΔΔCt法进行目的基因与管家基因GAPDH的相对定量；

(5)、WesternBlot检测肝脏α-SMA的表达

(5-1)取新鲜肝组织50-150mg，剪成小块后放入1.5ml Eppendorf管中，加入M-PER蛋白抽提液500-900μl后，用小塑料棒于冰上研磨，冰上裂解10分钟；

(5-2)4℃ 12000rpm离心10分钟，将上清转移到新的1.5ml Eppendorf管中；

(5-3)加入150-200μl 5×SDS-PAGE上样缓冲液，涡旋震荡后，沸水浴10分钟，制备好的样品进行常规WesternBlot实验检测。