[发明专利]合成乳酰N-新四糖的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种合成乳酰N-新四糖的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的重组大肠杆菌是在大肠杆菌宿主基因组上敲除β-半乳糖苷酶lacZ基因、葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶nagB基因、UDP-乙酰氨基葡萄糖表异构酶wecB基因、UDP-葡萄糖脱氢酶ugd基因，并在基因组上过表达乳糖运输酶lacY基因、β-1,3-N-葡糖氨基酶lgtA基因和β-1,4半乳糖转移酶lgtB基因；

所述的β-1,3-N-葡糖氨基酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述的β-1,4半乳糖转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述的乳糖运输酶lacY基因的Gene ID为949083。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的β-半乳糖苷酶lacZ基因的Gene ID为945006，葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶nagB基因的Gene ID为945290，UDP-乙酰氨基葡萄糖表异构酶wecB基因的Gene ID为944789，UDP-葡萄糖脱氢酶ugd基因的Gene ID为946571。

3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的大肠杆菌宿主为大肠杆菌MG1655。

4.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的重组大肠杆菌的β-1,3-N-葡糖氨基酶和β-1,4半乳糖转移酶的启动子是tac启动子。

5.权利要求1~4任一项所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、构建包含β-1,3-N-葡糖氨基酶和β-1,4半乳糖转移酶的重组片段lgtAB-tac；

S2、采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，依次敲除大肠杆菌MG1655中lacZ、nagB、wecB、ugd基因，得到敲除lacZ、nagB、wecB、ugd基因的重组菌；

S3、采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，在S2步骤得到的重组菌中过表达lacY基因，得到过表达lacY基因的重组菌；

S4、将重组片段lgtAB-tac转入S3步骤得到的重组菌中，得到所述的重组大肠杆菌。

6.权利要求1~4任一项所述的重组大肠杆菌在发酵生产乳酰-N-新四糖的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的应用具体包括如下步骤：将重组大肠杆菌的种子液以OD值0.1-0.2的接种量接入发酵培养基中培养至OD达到1.8~2.2时，在28~32℃下，以0.15~0.25mM的IPTG进行诱导45~50h。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养基的配方为：蛋白胨10~14g/L，酵母提取物22~26 g/L，甘油3~5 g/L，磷酸氢二钾2.2~2.5 g/L，三水磷酸氢二钾16.2~16.5 g/L，乳糖4~6 g/L。