[发明专利]一种用于检测阪琦肠杆菌的试剂盒、引物对、探针及方法

说明书

本发明公开了一种用于检测阪琦肠杆菌的试剂盒、引物对、探针及方法。所述的试剂盒包括RPA反应体系，所述的RPA反应体系包括RPA引物探针混合液，所述RPA引物探针混合液包括一引物对和探针，所述引物对中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针的核苷酸序列包含分别如SEQ ID NO.3所示、和如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。本发明的试剂盒、引物、探针及其组合特异性强、灵敏度高、检测结果准确，且具有快速、操作简单、结果判读简单等优点。

技术领域

本发明属于食源性致病菌快速诊断技术领域，具体涉及一种用于检测阪琦肠杆菌的试剂盒、引物对、探针及方法。

背景技术

阪琦肠杆菌(Enterobacter sakazakii)是革兰氏阴性兼厌氧型菌^[1]，属于肠杆菌科，作为危害婴幼儿和免疫力低下人群的关键致病菌^[2]，广泛存在于环境及配方奶粉中。阪琦肠杆菌作为具有安全隐患的食源性致病菌之一，国际上对其防控研究越来越重受到重视。建立针对该菌的检测方法快速准确检测该菌，降低感染及致病性风险就显得尤为重要。目前对阪琦肠杆菌的检测方法主要是分离培养法，然而传统检测方法存在许多不足，如操作方法繁琐、耗时周期长大致需要4-6天、灵敏度较低且容易造成假阳性污染，使得对该菌的快速诊疗带来极大的挑战。分子生物学检测方法具有快速灵敏度高等优点，为了满足快速准确的检测需求，利用阪琦肠杆菌特异性基因设计鉴定引物，建立以PCR检测技术为主的分子生物检测成为该菌检测的首要方法。但是，由于PCR^[3，4]检测方法具有操作繁琐，假阳性污染的风险，且对扩增仪器的要求较高，价格昂贵，对实验操作人员要求较高等缺点，使得该方法只适用于实验室检测，极大限制了该检测方法在基层的推广和使用。因此建立检测快速，准确性及灵敏度高，且对仪器设备要求较低的新型检测技术对于阪琦肠杆菌在基层的快速检测具有十分重要的意义。

重组酶聚合酶扩增技术(RPA)是由ASM Scientific公司推出的核酸恒温扩增技术^[5，6]，具有特异性强、灵敏快速等特点。和普通PCR原理相似的是双链DNA的解旋和扩增都需要重组酶和聚合酶来完成，不同的是，RPA不需要高温加热解旋DNA双链，而是通过重组酶在DNA模板上寻找同源序列，定位后通过双链DNA同源位点互换形成稳定的D-Loop结构。在25-45℃恒温条件下就可以进行扩增，且整个反应过程只需要20min，其扩增产物可以和琼脂糖凝胶电泳分析、实时荧光定量测定法及横向流动试纸条检测法等方法结合，具有直观性。与其他等温扩增技术相比，不需要昂贵的实验仪器，且具有特异性强、灵敏度高、快速、操作简便、适用于现场快速诊断等特点^[5，7]，为疾病早期诊断及时治疗提供了极大的可行性。目前有文献报道该快速检测技术广泛应用在细菌、病毒和寄生虫的检测和医学、食品检测等领域^[8，9]。

常规RPA产物使用琼脂糖凝胶电泳进行检测，具有操作简单，费用低廉等优点，但是在进行检测之前需要用产物纯化试剂盒进行纯化，否则造成拖带难以进行实验结果分析。本研究将重组酶聚合酶扩增技术与侧流层析试纸条结合，在扩增过程中添加带生物素biotin标记的引物和带羧基荧光素FAM标记的探针，使得扩增产物同时带有生物素和荧光素标记的双标记扩增产物，这种扩增产物使用基于“夹心法”的侧流试纸条进行检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为克服现有技术中检测阪琦肠杆菌耗时长、操作繁琐、需要昂贵仪器、需要专业技术人员、且灵敏度低等的缺陷，提供一种用于检测阪琦肠杆菌的试剂盒、引物对、探针及方法，所述的试剂盒包括RPA反应体系，所述的RPA反应体系包括RPA引物探针混合液，所述RPA引物探针混合液包括一引物对和探针，所述引物对中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述探针包含如SEQ ID NO.3所示、以及如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。