[发明专利]一种翘嘴红鲌和团头鲂肌间刺变粗的分子育种方法

权利要求书

1.一种翘嘴红鲌和团头鲂肌间刺变粗的分子育种方法，其特征在于，步骤如下：

(1)克隆翘嘴红鲌和团头鲂mstn基因核苷酸序列；

(2)采用基因敲除方法构建翘嘴红鲌和团头鲂mstn基因的缺失突变体品系；

(3)筛选肌间刺粗大个体：选取经过基因敲除后比同龄野生种肌肉肥大的翘嘴红鲌和团头鲂分别进行杂交，收集受精卵，孵化培育后获得稳定遗传的纯合突变体，检测肌间刺变化并筛选肌间刺粗大个体。

2.根据权利要求1所述翘嘴红鲌和团头鲂肌间刺变粗的分子育种方法，其特征在于，所述步骤1)中克隆的翘嘴红鲌mstn基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，克隆的团头鲂mstn基因核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.根据权利要求1所述翘嘴红鲌和团头鲂肌间刺变粗的分子育种方法，其特征在于，所述步骤1)中克隆翘嘴红鲌mstn基因核苷酸序列的引物对为：

F:5’-CATGTGGTCCAGTGGGTAATG-3’；

R:5’-GTTGATGGGAGACATCTTGGTG-3’；

所述步骤1)中克隆团头鲂mstn基因核苷酸序列的引物对为：

F:5’-GCAAACATCCTCTAGCACGC-3’；

R:5’-CCACAGCGGTCTACTACCA-3’。

4.根据权利要求1所述翘嘴红鲌和团头鲂肌间刺变粗的分子育种方法，其特征在于，步骤(2)所述的基因敲除方法为TALEN法或crispr/cas9法。

5.根据权利要求4所述翘嘴红鲌和团头鲂肌间刺变粗的分子育种方法，其特征在于，采用CRISPR/Cas9基因敲除方法构建翘嘴红鲌和团头鲂mstn基因的缺失突变体品系的方法，具体为：

①在翘嘴红鲌和团头鲂mstn基因序列的外显子区域设计靶点，将设计的靶点体外转录合成sgRNA，并与Cas9 mRNA按比例混合，配成用于基因编辑注射的药物；

②取性腺发育成熟的翘嘴红鲌和团头鲂，注射绒促性素HCG，间隔1～3天后进行人工授精，待胚胎吸水膨胀后开始注射①中的基因编辑注射药物，注射时将药物准确注射到一细胞期的细胞内，每个胚胎注射体积约2nL；

③注射完成后随机抽取三组注射12h后的翘嘴红鲌和团头鲂胚胎，每组三颗，用剪刀剪碎胚胎，提取基因组DNA，用荧光毛细管电泳法检测敲除效率；

④将检测有效的胚胎饲养至1个月，剪取个体尾鳍，提取基因组DNA，进行荧光STR检测，再通过分子克隆确定突变基因型，将编辑数目非3n的有效突变F0代留下，将有效突变的翘嘴红鲌和团头鲂饲养至成年。

6.根据权利要求5所述翘嘴红鲌和团头鲂肌间刺变粗的分子育种方法，其特征在于，所述步骤①中基因编辑注射的药物含Cas9 mRNA终浓度300ng/μL，sgRNA终浓度50ng/μL。

7.根据权利要求5所述翘嘴红鲌和团头鲂肌间刺变粗的分子育种方法，其特征在于，所述步骤①设计的翘嘴红鲌mstn基因敲除靶点序列为以下序列中的至少一条：

exon1-target1:5’-GGTTCTGGGGGATGACAGTA-3’；

exon1-target2:5’-GGGATCAGTACGATGTTCTG-3’；

exon1-target3:5’-GGAGCCTTCCACAGCCACGG-3’；

exon2-target1:5’-GGGCTAATGCCCGTTACGGA-3’；

exon2-target2:5’-GGACAACCGGAGACCAACTG-3’；

exon2-target3:5’-GGGTCTTCCTCCGTCCGTAA-3；

所述步骤①设计的团头鲂mstn基因敲除靶点序列为以下序列中的至少一条：

exon1-target1:5’-GGTTCTGGGGGATGACAGTA-3’；

exon1-target2:5’-GGAGCCTTCCACAGCCACGG-3’；

exon1-target3:5’-GGGATCAGTACGACGTTCTG-3’。