[发明专利]酶口袋和酶分子表面的定向五位点突变蛋白GGPPS

说明书

本申请属于烟草基因工程技术领域，具体涉及GGPPS定向突变蛋白。现有GGPPS蛋白的154、161和218这三个位点位于酶的催化口袋，209和233这两个位点位于酶分子表面；基于这五个位点，本申请提供了GGPPS系列定向突变蛋白，其中包括：系列单位点突变蛋白、双位点突变蛋白、三位点突变蛋白、四位点突变蛋白、五位点突变蛋白。发明人利用CAST技术构建“小而精”的突变体文库，通过进一步筛选以及基于定向进化需要，发明人对特定位点氨基酸突变类型做了详细分析。初步实验结果表明，特定位点氨基酸突变后，β‑胡萝卜素合成量得到了明显提高，为进一步作物新品种培育奠定了一定技术基础。

技术领域

本申请属于烟草基因工程技术领域，具体涉及GGPPS定向突变蛋白专利申请事宜。

背景技术

类胡萝卜素是一种重要的质体色素，具有重要的生理作用，与植物的生长发育和光合作用密切相关，影响作物品质性状。牻牛儿基牻牛儿基二磷酸(geranylgeranyldiphosphate，GGPP)是类胡萝卜素、叶绿素和维生素E的植醇侧链、赤霉素以及二萜植保素的共同前体。GGPP由牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(GGPP synthase, GGPPS)催化产生，3分子异戊烯基焦磷酸（IPP）和1分子烯丙基异构体二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)，在GGPPS的作用下缩合生成C20的GGPP。

GGPP是类胡萝卜素合成的起始底物，能够被类胡萝卜素合成通路的端口酶八氢番茄红素(phytoene)合酶(phytoene synthase，PSY)催化形成八氢番茄红素，用于合成类胡萝卜素。对植物GGPPS基因家族的大量研究例证表明，该家族成员不仅编码萜类合成通路上游的重要酶蛋白，而且还直接参与调控植物萜类合成的各个通路，在调控方面发挥着核心作用。

现有研究中，对于类胡萝卜素合成途径虽然已有较多研究，但从植物改造角度而言，如果能够利用基因工程技术实现定向化的选育和培育，是实现植物最大化利用的重要技术前提。

作为合成生物学的关键性技术之一，定向生物进化技术获得了2018年诺贝尔化学奖。该技术广泛用于酶的活性设计，通过定向进化，可有效克服天然酶在环境耐受性、立体/区域选择性、底物特异性、催化效率及产物抑制性等方面存在的缺点，使得自然界成千上万年的进化历程在实验室内较短时间完成。

在酶的定向进化技术发展过程中，传统定向进化时，如利用易错 PCR、DNA混组、序列饱和突变、随机引发体外重组等技术时，存在突变效率低、筛选工作量大等缺点，制约了酶分子的体外定向进化的应用。组合活性中心饱和突变策略 (Combinatorial active-site saturation test，CAST) 则是一种较新的定向进化突变策略，该技术基于蛋白的结构信息，首先借助计算机的模拟基础，随后在酶催化活性中心周围选取与底物有直接相互作用的氨基酸残基，通过构建“小而精”的突变体文库，从而减少突变体文库的筛选规模。

总体上，虽然定向进化技术可以加快作物基因的进化历程，为作物品质的改良提供优质基因，但由于发展时间较短，且存在其他技术难题，因此目前定向进化技术仍未用于植物基因的改造。

烟草作为基因工程研究的模式作物之一，同时烟草内类胡萝卜素含量直接影响了烟草的品质性状。因此，如能结合定向进化对烟草萜类合成基因进行定向改造，对于加快烟草育种具有十分重要的应用意义，同时也可为其他作物的遗传育种奠定一定技术基础。

发明内容

通过对牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(GGPP synthase，GGPPS)酶结构研究，结合定向进化技术，本申请目的在于提供若干具有更好酶活的GGPPS及烟草GGPPS基因，从而为烟草育种、烟草新品种培育提供一种新的技术思路，同时也为其他作物育种和品种改良奠定一定技术基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。