[发明专利]一种基于乳糖通过氨基-环氧开环反应构建肝靶向阳离子基因载体及其制备方法

说明书

本发明公开了一种基于乳糖通过氨基‑环氧开环反应构建肝靶向阳离子基因载体的制备方法，步骤为：1)将氨基化乳糖与异氰尿酸三缩水甘油酯在二甲基亚砜中，在惰性气体保护下进行反应，反应温度40～60℃，反应24～48小时；2)步骤1)反应结束后，加入乙二胺，升温至50～70℃，反应1～3小时，反应结束后透析，得到白色絮状聚合物。基于乳糖通过绿色且反应条件温和的氨基‑环氧开环反应制备低毒高效并且具有肝脏靶向效果的阳离子基因载体，不但能够有效实现基因转染，而且可以实现核酸的靶向递，并且能够介导CRIPSR/Cas9基因编辑系统实现有效的基因编辑。

技术领域

本发明属于非病毒基因载体领域，涉及一种基于乳糖通过氨基-环氧开环反应构建肝靶向阳离子基因载体及其制备方法。

背景技术

基因载体作为将外源基因导入到细胞的工具，其本身应该低毒性并且不会引起免疫反应；其次，其要能跟基因形成具有稳定结构的复合物，同时也不会导致基因结构的变化；最后，这种载体最好能够具有一定的靶向和降解作用，这样可以针对特定的细胞进行治疗并且可以降低其滞留导致的副作用。目前人们广泛使用的基因载体包括两类：病毒载体(viral vector)和非病毒载体(non-viral vector)。病毒载体主要包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒以及单纯疱疹病毒。这种病毒载体一般能够轻易的客服细胞屏障和免疫防御机制，从而其具有很高的转染效率。但是这种载体缺乏安全性，很容易导致致癌作用与自身免疫反应(unexpected immune response)和白细胞的病毒变化，严重时会造成器官衰竭从而导致死亡。同时病毒载体还会引起插入突变的现象，可能导致宿主细胞的恶性转化，而且病毒载体携带基因的能力有限，不利于大规模工业生产。针对以上病毒载体的缺点，人们将更多的目光投向了非病毒载体。其本身安全性能高，很多具有生物相容性或者具有生物可降解能力的基因载体都是低毒性的，而且具有很低的免疫毒性。相对于病毒载体而言，虽然这种非病毒性载体的转染效率并不是很高，有的时候很难克服细胞内外的各种屏障，但是其能够携带更多的基因，同时还能大规模工业化生产，具有很高的商业潜力。所以其发展潜力推动了非病毒载体的研究与开发。目前而言阳离子聚合物是人们使用频率最高的非病毒载体。这种阳离子非病毒性载体可以有效的通过电荷的相互作用络合上基因，从而形成带正电荷纳米级的复合体(complex)，从而能够保护基因穿过细胞膜以防止被核酸酶所降解，从而保证基因的顺利表达。

天然糖类化合物是自然界中一类广泛存在的天然产物，包括单糖，低聚糖以及多糖。天然糖类化合物由于其优秀的生物相容性，生物可降解性和独特的生物活性特性，已被作为优秀的基因载体材料被全世界范围内广泛研究。乳糖是一种二糖，乳糖分子由一分子葡萄糖和一分子半乳糖分子通过糖苷键相连，根据乳糖中葡萄糖单元的不同，又可以被分为α-乳糖和β-乳糖。根据研究发现，乳糖分子能够依靠分子中的半乳糖单元与去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)进行特异性识别，而ASGPR受体在肝实质细胞表面大量存在，因此乳糖是一种具有肝脏靶向性的天然糖类化合物。另外，在阳离子基因载体中引入二硫键基团，利用二硫键与生物体中的谷胱甘肽的还原响应来实现载体在生物体内的降解的报道已经屡见不鲜，这种方法不仅能够降低载体的毒性，而且有利于核酸释放。

氨基-环氧开环反应是一种新颖的逐步聚合方法。它主要依靠伯胺基团和环氧基团的化学反应。随着环氧环的打开将出现仲胺基和羟基。仲胺基可络合带负电荷的核酸，而羟基可提供亲水性。氨基-环氧开环反应不依赖苛刻的反应条件，反应过程温和绿色。