[发明专利]一种合成MK-4的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种合成MK‑4的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用，本发明构建了一种合成MK‑4的重组枯草芽孢杆菌，重组菌是以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168为宿主，整合来源于蓝藻Synechocystis sp.PCC 6803的menA、menG、crtE基因，并敲除hepT。并在重组菌的染色体上整合dxs、dxr、ispD‑ispF基因，加强MEP途径关键基因dxs、dxr、ispD‑ispF表达。本发明的重组枯草芽孢杆菌合成的MK‑4在胞外积累量达到78mg/L，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产MK‑4奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种合成MK-4的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用，属于代谢工程技术领域。

背景技术

Menaquinones是一类广泛存在于微生物体内的化合物，在孢子形成、氧化磷酸化和电子传递等方面起着重要的作用。目前，存在有14种MK-n，其中n 为侧链上的异戊二烯单位数。这条尾巴的长度因微生物的不同而不同。在人体中，menaquinones被称为维生素K2；它们是维生素K依赖蛋白谷氨酸残基翻译后转化的重要辅助因子。Menaquinones在凝血、预防骨质疏松、预防糖尿病、缓解心血管钙化、抑制炎症等方面具有重要作用。因此，维生素K2在食品、保健和制药工业中被广泛用作药物治疗和膳食补充剂。

MK-4的化学合成具有挑战性，因为全反式构型的MK-4才具有生物活性。微生物生产MK-4具有选择性生产全反式异构体的优势；因此，研究者已经使用野生型Bacillussubtilis natto和Flavobacterium sp.238-7-K3-15菌株对MK-4 进行生产。枯草芽孢杆菌被普遍认为是安全的(GRAS)，它生长速度快，其遗传特性良好，有合成生物学工具和专门的文库。

因此，我们选择枯草芽孢杆菌作为平台微生物进行合理的路线工程设计，以提高MK-4的产量。Bacillus subtilis 168在代谢工程有相当大的潜力生产 MK-4。因此，如何利用枯草芽孢杆菌，通过代谢工程改造并发酵合成MK-4成为本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种合成MK-4的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用，构建的重组枯草芽孢杆菌可以高效合成MK-4。

本发明的第一个目的是提供一种合成MK-4的重组枯草芽孢杆菌，所述的重组枯草芽孢杆菌是以枯草芽孢杆菌为宿主，在基因组上整合表达来源于 Synechocystis sp.PCC6803的menA、menG、crtE基因，并敲除hepT基因；并在基因组上加强表达MEP途径基因dxs、dxr或ispD-ispF中的一种或多种得到的。

进一步地，所述的menA基因表达的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示； menG基因表达的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；crtE基因表达的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步地，所述的hepT基因的Gene ID为939002。

进一步地，所述的dxs基因表达的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；dxr 基因表达的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；ispD-ispF基因表达的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

进一步地，所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌168。

本发明的第二个目的是提供所述的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)通过融合PCR构建包含dacA基因同源臂、menA基因、P₄₃启动子、博来霉素抗性基因序列的重组片段；将重组片段转化Bacillus subtilis168，获得含menA基因菌株；